العزلة والتركيبية تحليل النبات البشرة الدهن البوليستر مونمرات

تعتمد النباتات الوعائية على طبقات خارج خلوية تعمل كحواجز مقاومة للماء بين أنسجة النبات والبيئة الخارجية. وتقوم هذه الخلايا المحبة للدهون، والتركيبات المرتبطة بها، بالحد من العدوى الممرضة وتنظيم النقل السلبي للغازات والماء والمواد المذابة من وإلى أنسجة النبات. ومن أهم هذه الحواجز كيوتيكل النبات، وهو تركيب معقد ينفرد به النبات.

الكيوتين عبارة عن بوليستر ليبيدي من الجليسرول غير قابل للذوبان، ويشكل المصفوفة الهيكلية للكيوتيكل ويرتبط بالشّموع القابلة للاستخلاص بالمذيبات. نقدم هنا تقنية موثوقة لتقييم تركيب البوليسترات الليبيدية في الأنسجة النباتية المزيلة من الدهون. في هذا البروتوكول، يتم حصاد عينات من الأنسجة الكاملة، وتجنيسها، ثم إزالة الدهون منها بشكل شامل من خلال سلسلة من عمليات الاستخلاص بالمذيبات لإزالة الليبيدات القابلة للذوبان في المذيبات، بما في ذلك الشّموع الكيوتيكلية والطبقية الخارجية.

ثلاثي الجليسرول في ليبيدات الغشاء. يتم بعد ذلك إزالة بلمرة العينات إلى مونومرات ليبيدية مكونة لها عن طريق التحلل الميثيلي المحفز بميثوكسيد الصوديوم. تُضاف كواشف المحاكاة لتحويل مجموعات الهيدروكسيل عبر عملية الميثيلة إلى مشتقات ثلاثي ميثيل سليل المقابلة لها، والتي تكون مناسبة للتحليل باستخدام الكروماتوغرافيا الغازية.

تُنقل بعدها البقايا المشتقة إلى قوارير GC وتُحمّل في جهاز A-G-C-M-S للتحليل، مما ينتج عنه كروماتوغرام يحدد التركيب المونومري للبوليسترات الحيوية الموجودة في العينات المستخلصة. هنا نقوم بجمع عينات من الأوراق الكاملة من نباتات arabidopsis ANA الناضجة من النوع البري وطفرتين.

لأغراض الاستخلاص والتحليل، أضف 0.5 grams من النسيج إلى أنابيب زجاجية نظيفة تم شطفها مسبقاً بالكلوروفورم. ضع 100 milliliters من الإيزوبروبانول في دورق وأضف بوتيلات هيدروكسي التولوين لتركيز 0.01%. يُعد BHT مضاد أكسدة يُضاف لحماية الروابط المزدوجة والأحماض الدهنية من الأكسدة أثناء عمليات الاستخلاص بالمذيبات. قم بتسخين المذيب مسبقاً في حمام مائي إلى 85 degrees تقريباً.

أضف 25 milliliters من الإيزوبروبانول المسخن لكل جرام من أنسجة النبات، ثم قم بتحضين العينات في جهاز LOC الحراري عند 85 degrees لمدة 15 minutes. اترك الأنابيب لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة مع ارتداء واقيات الأذن والعين. وأخيراً، اطحن العينات باستخدام مجانس لتحقيق تشتت متجانس، ثم أغلق الأنابيب بأغطية لولبية ورجها بسرعة 100 RPM لمدة دقيقة إلى دقيقتين، ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 800 G لمدة 10 minutes.

لفصل الطور العضوي عن المواد ذات الكثافة الأعلى المتراكمة في الراسب، قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه باستخدام ماصة باستور أو أداة نقل سائل. احذر من تعكير الراسب. أضف حجماً مساوياً من الإيزوبروبانول في درجة حرارة الغرفة ورج العينات طوال الليل.

قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 100 RPM، ثم تخلص من الطافي. أضف 25 ملليلتر من محلول الكلوروفورم والميثانول بنسبة 2:1 لكل جرام من النسيج، ورج العينات طوال الليل، ثم قم بالطرد المركزي والتخلص من الطور العضوي. بعد ذلك، كرر هذه العملية باستخدام محلول الكلوروفورم والميثانول بنسبة 1:2.

جفف الراسب طوال الليل وانقل الأنابيب من خزانة استخراج الغازات إلى مجفف فراغي يحتوي على كبريتات الكالسيوم اللامائية لإزالة الماء من العينات على مدى ثلاثة أيام على الأقل أو حتى يتم الوصول إلى كتلة ثابتة. وبمجرد جفاف العينات تماماً، تصبح جاهزة لعملية إزالة الدهون عن طريق التحلل المعدني المحفز بـ sodium meth oxide. أضف محلولين من المعايير الداخلية إلى الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة الجافة باستخدام حقنة زجاجية، بدءاً بـ 25 µL من methyl HETO decanoate، و 25 µL من omega pentec and lactone.

لبدء عملية البلمرة العميقة، أضف 0.9 milliliters من ميثيل أسيتات إلى العينات، يليه 1.5 milliliters من محفز ميثوكسيد الصوديوم و3.6 milliliters من الميثانول. تُحضن العينات عند 60 درجة لمدة ساعتين مع الرج الدوري باستخدام جهاز الفورتكس داخل نظام التفاعل، حيث تتفاعل بوليسترات الدهون مع أنيونات الميثوكسيد النيوكليوفيلية لتكوين وسائط رباعية السطوح غير مستقرة، والتي تتفكك بسهولة إلى أحماض دهنية، وإسترات ميثيلية، وأنيونات أكسيد. وتعد هذه الأكاسيد قواعد مرافقة تتفاعل مع الميثانول لإعادة توليد أنيونات الميثوكسيد النشطة تحفيزياً، مما يدعم استمرار تفاعلات البلمرة العميقة الإضافية.

في حالة وجود الماء في النظام، فإنه سيتفاعل مع ميثوكسيد الصوديوم لتكوين هيدروكسيد الصوديوم، وهو قاعدة قوية تحول البوليسترات بشكل غير عكسي إلى أحماض دهنية حرة غير مرغوب فيها. وبدلاً من ذلك، ومن أجل منع التحلل المائي، يُضاف خلات الميثيل لإزالة أي هيدروكسيد صوديوم موجود داخل النظام.

اترك الأنابيب حتى تبرد وتصل إلى درجة حرارة الغرفة. بعد انتهاء فترة التحضين، استخلص المونومرات بإضافة 10 milliliters من methylene dichloride إلى كل أنبوب. ثم أضف 1.5 milliliters من glacial acidic acid لتحميض العينات.

املأ الأنابيب بمحلول كلوريد الصوديوم بتركيز 0.5 molar، واستخدم جهاز الـ vortex للمزج جيداً ثم قم بالطرد المركزي لعدة دقائق. تحت خزانة استخلاص الغازات، انقل الطور العضوي السفلي بعناية باستخدام الماصة إلى أنابيب نظيفة مغسولة مسبقاً ومتوسطة الحجم.

اغسل العينات مرة أخرى بمحلول ملحي، ثم استخدم جهاز رج vortex وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الطور المائي العلوي، ثم أضف كبريتات الصوديوم اللامائية إلى العينات كعامل تجفيف لإزالة كميات ضئيلة من الماء المتبقية في المحلول، ورج العينات بجهاز vortex ثم استخدم جهاز الطرد المركزي، وانقل المذيب إلى أنابيب صغيرة نظيفة ومغسولة مسبقاً، وضع الأنابيب في مبخر نيتروجين لتبخير المذيب والحصول على رواسب جافة من المونومرات. وباستخدام حقنة زجاجية، أضف 100 µL من البورين و100 µL من B-S-T-F-A لتحويل مجموعات الهيدروكسيل إلى مشتقات ثلاثي ميثيل سيليل متطايرة.

يتم تحضين العينات عند 100 درجة لمدة 10 دقائق. تُترك الأنابيب لتبرد ويتبخر المحتوى تحت غاز النيتروجين. يُضاف 500 µL من محلول HEPTANE والتولوين بنسبة واحد إلى واحد لإعادة إذابة الرواسب، ثم يتم إجراء عملية طرد مركزي قصيرة لها.

انقل عينات المشتقات إلى قوارير GC التي تحتوي على أنابيب إدراج سعة 400 microliter. أغلق القوارير وحمِّل العينات في جهاز كروماتوغرافيا الغاز، والذي يقوم بحقنها في عمود شعري للتحليل، ثم يتم الكشف عن النواتج المنفصلة بواسطة مطياف الكتلة الرباعي. تتم معالجة البيانات الخام المكتسبة من تحليل GCMS وعرضها في شكل كروماتوغرام لكل عينة.

يتم تحديد المونومرات الفردية المقابلة للقمم الكروماتوغرافية المختلفة من خلال أطياف الكتلة النوعية الخاصة بها. وفي أزمنة الاحتجاز بكروماتوغرافيا الغاز (GC)، يتم تحديد كميات المونومرات الفردية باستخدام طريقة التكميم بالمعيار الداخلي، مما يسمح بإجراء مقارنات لوفرة المونومرات وتركيبها بين العينات. تظهر هنا كروماتوغرامات متراكبة من تحليلات تمثيلية للمونومرات المنطلقة من نسيج ورقة خراج أرنب المقابلة للنمط البري وأليلين طافريين لجين يشفر إنزيم P450 monooxygenase، مما يظهر ملفات مونومرية متمايزة.

تظهر نتائجنا وجود فروق جوهرية في وفرة ثلاثة مونومرات رئيسية من الكيوتين بين نباتات Arabidopsis من النوع البري والنباتات الطافرة. يُعد هذا البروتوكول طريقة قوية لتقدير تركيب البوليسترات الدهنية النباتية من خلال عزل وتحديد وقياس كمية المونومرات المكونة لها. وتتميز هذه الإجراءات بقابليتها للتوسع، حيث يمكن تكييفها بسهولة لمعالجة كميات كبيرة من المواد النباتية المختلفة، بما في ذلك الجذور والبذور والأوراق والأنسجة الكاملة الأخرى.

تُطبق هذه التقنية في الدراسات التي تبحث في تنظيم التخليق الحيوي وتوزيع الكيوتين والسوبرين في النباتات الراقية.