العزلة والتركيبية تحليل النبات البشرة الدهن البوليستر مونمرات

تعتمد النباتات الوعائية على طبقات خارج الخلية تعمل كحواجز مقاومة للماء بين الأنسجة النباتية والبيئة الخارجية. هذه الخلايا المحبة للدهون ، على الرغم من الهياكل المرتبطة بها ، تقيد العدوى المسببة للأمراض وتنظم النقل السلبي للغازات والماء والمواد الذائبة داخل وخارج الأنسجة النباتية. أحد العوائق المهمة هو بشرة النبات ، وهي بنية معقدة فريدة من نوعها للنباتات.

Cutin عبارة عن بوليستر دهني من الجلسرين غير قابل للذوبان يشكل المصفوفة الهيكلية للبشرة ويرتبط بالشموع القابلة للاستخراج بالمذيبات. نقدم هنا تقنية موثوقة لفحص تكوين البوليستر الدهني والاحتفاظ de الأنسجة النباتية الدهنية. في هذا البروتوكول ، يتم حصاد عينات الأنسجة الكاملة وتجانسها وتحويلها بشكل شامل ، وتتدميرها بواسطة سلسلة من عمليات استخراج المذيبات لإزالة الدهون القابلة للذوبان بالمذيبات ، بما في ذلك الشموع الجلدية والشموع الخاصة epi.

الدهون الثلاثية في الدهون الغشائية. ثم يتم بلمرة العينات إلى مونومرات الدهون المكونة لها عن طريق تحلل الميثيل المحفز بأكسيد ميثيوم الصوديوم. تضاف كواشف المحاكاة إلى مجموعات هيدروكسيل الميثيل عبر إلى مشتقات خلايا ثلاثي الميثيل المقابلة لها المناسبة للتحليل الكروماتوجرافي للغاز.

ثم يتم نقل المخلفات المشتقة إلى قوارير GC وتحميلها في A-G-C-M-S لتحليلها ، مما ينتج عنه رسم كروماتوغرامي ، يميز التركيب الأحادي للبوليستر الحيوي. موجود في العينات المستخرجة. هنا نحصد عينات أوراق كاملة من النوع البري واثنين من طفرات نباتات arabidopsis ANA الناضجة.

للاستخراج والتحليل ، أضف 0.5 جرام من الأنسجة لتنظيف الأنابيب الزجاجية التي تم شطفها مسبقا بالكلوروفورم. ضع 100 مل من الأيزوبروبانول في قارورة وأضف هيدروكسي التولوين البوتيل إلى تركيز 0.01٪ BHT هو أحد مضادات الأكسدة المضافة لحماية الروابط المزدوجة والأحماض الدهنية من الأكسدة أثناء استخراج المذيبات. سخن المذيب في حمام مائي إلى حوالي 85 درجة.

أضف 25 مل من الأيزوبروبانول الساخن لكل جرام من الأنسجة النباتية واحتضان العينات في الحرارة LOC عند 85 درجة لمدة 15 دقيقة. اترك الأنابيب لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة وحماية الأذن والعين. أخيرا ، قم بطحن العينات باستخدام الخالط لتحقيق أنابيب مانعة للتسرب متجانسة مع أغطية لولبية ورجها عند 100 دورة في الدقيقة لعينة إلى عينتين من أجهزة الطرد المركزي عند 800 جم لمدة 10 دقائق.

لفصل المرحلة العضوية عن المواد عالية الكثافة المضغوطة في الحبيبات ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها باستخدام باستور أو بروبنت. احرص على تجنب إزعاج الحبيبات. أضف كمية متساوية من الأيزوبروبانول في درجة حرارة الغرفة ورج العينات طوال الليل.

عند 100 دورة في الدقيقة ، قم بالطرد المركزي للعينات وتخلص من المادة الطافية. أقوم بإضافة 25 مل من محلول اثنين إلى واحد من الكلوروفورم والميثانول وبيرغرام الأنسجة ، ونهز العينات بين عشية وضحاها وأجهزة الطرد المركزي والتخلص من المرحلة العضوية. ثم كرر هذه العملية باستخدام محلول ميثانول كلوروفورم واحد إلى اثنين

جفف الحبيبات طوال الليل وانقل الأنابيب من غطاء الدخان إلى مجفف فراغي يحتوي على كبريتات الكالسيوم اللامائية لتجفيف العينات على مدى ثلاثة أيام على الأقل أو حتى يتم تحقيق كتلة ثابتة. بمجرد أن تجف العينات تماما ، تكون جاهزة للإزهار عن طريق التحليل الميتاليفزي المحفز لأكسيد ميثامفيتامين الصوديوم. أضف محلين من المعايير الداخلية إلى الأنابيب التي تحتوي على أنسجة جافة باستخدام حقنة زجاجية ، بدءا من 25 ميكرولتر من ميثيل هيتو ديكانوات ، و 25 ميكرولترا من أوميغا بنتيك ولاكتون.

لبدء البلمرة العميقة ، أضف 0.9 مل من أسيتات الميثيل إلى العينات ، متبوعا ب 1.5 مل من محفز أكسيد ميثامفيتامين الصوديوم و 3.6 ملليلتر من الميثانول. احتضان العينات عند 60 درجة لمدة ساعتين مع دوامة دورية داخل نظام التفاعل ، تتفاعل البوليستر الدهني مع أنيونات أكسيد الميثامفيتامين المحبة للنواة لتشكيل مواد وسيطة رباعية السطوح غير مستقرة ، والتي تنفصل بسهولة إلى الأحماض الدهنية ، واسترات الميثيل ، وأنيونات أكسيد. هذه الأكاسيد عبارة عن قواعد مترافقة وتتفاعل مع الميثانول الذي يجدد أنيونات الميثامفيتامين IDE النشطة بشكل حفيز ، وبالتالي الحفاظ على تفاعلات بلمرة عميقة إضافية.

إذا كان الماء موجودا في النظام ، فسوف يتفاعل مع أكسيد ميثامفيتامين الصوديوم لتكوين هيدروكسيد الصوديوم. قاعدة قوية تحول البوليستر بشكل لا رجعة فيه إلى أحماض دهنية حرة غير مرغوب فيها. بدلا من fas لمنع التحلل المائي ، يضاف أسيتات الميثيل لإزالة أي هيدروكسيد الصوديوم داخل النظام.

اترك الأنابيب لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، استخرج المونومرات بإضافة 10 ملليلتر من ثاني كلوريد الميثيلين إلى كل أنبوب. ثم أضف 1.5 مل من الحمض الحمضي الجليدي لتحمض العينات.

املأ الأنابيب بمحلول كلوريد الصوديوم 0.5 مولار ، والدوامة جيدا وجهاز الطرد المركزي لدقائق. تحت غطاء الدخان. انقل الطور العضوي السفلي بعناية بواسطة الماصة إلى أنابيب نظيفة ومتوسطة الحجم مغسولة مسبقا.

اغسل العينات مرة أخرى بدوامة المحلول الملحي وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المرحلة المائية العلوية ، ثم أضف كبريتات الصوديوم اللامائية إلى العينات كعامل تجفيف لإزالة كميات ضئيلة من الماء المتبقية في عينات دوامة المحلول ، وأجهزة الطرد المركزي ، ونقل المذيب لتنظيف الأنابيب الصغيرة الحجم المغسولة مسبقا ، وتحميل الأنابيب في مبخر النيتروجين لتبخر المذيب والحصول على بقايا جافة من المونومرات. باستخدام حقنة زجاجية ، أضف 100 ميكرولتر من البيورين و 100 ميكرولتر من B-S-T-F-A لتحويل مجموعات الهيدروكسيل إلى مشتقات خلايا ثلاثية الميثيل المتطايرة.

احتضان العينات على حرارة 100 درجة لمدة 10 دقائق. اترك الأنابيب تبرد وتتبخر تحت غاز النيتروجين. أضف 500 ميكرولتر من محلول التولوين الهيبتان واحد إلى واحد إلى البقايا الذائبة باللون الأحمر ، والتي يتم بعد ذلك طردها لفترة وجيزة.

نقل العينات المشتقة إلى قوارير GC تحتوي على 400 ميكرولتر إدراج. قم بإحاطة عينات تحميل القوارير في كروماتوجراف الغاز ، والذي يحقنها في عمود شعري لتحليلها ، ثم يتم الكشف عن الشطف بواسطة مطياف الكتلة الرباعي. تتم معالجة البيانات الأولية التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل GCMS وتقديمها كمخطط كروماتوغرامي لكل عينة.

يتم تحديد المونومرات الفردية المقابلة لقمم كروماتوغرافية مختلفة من خلال أطياف الكتلة الخاصة بها. في أوقات الاحتفاظ بالمونومرات GC ، يتم تحديد كميات المونومرات الفردية باستخدام الطريقة القياسية الداخلية للقياس الكمي ، مما يتيح إجراء مقارنات بين وفرة المونومر وتكوينه بين العينات. تظهر هنا مخططات كروماتوغرافية متراكبة من تحليلات تمثيلية للمونومرات ، تم إطلاقها من نسيج أوراق خراج الأرانب المقابل للنوع البري وأليلين متحولين لجين يشفر إنزيم P four 50 أحادي الأكسجين يوضح ملامح أحادية متميزة.

تظهر نتائجنا اختلافات كبيرة ، وفرة ثلاثة نباتات رئيسية من القطن ، والمونومرات ، والنوع البري والنباتات المتحولة. هذا البروتوكول هو طريقة قوية لفحص تكوين البوليستر الدهني النباتي عن طريق عزل وتحديد المونومرات المكونة لها. الإجراء قابل للتطوير ويمكن تكييفه بسهولة لمعالجة الكميات السائبة من المواد النباتية المختلفة ، بما في ذلك الجذور والبذور والأوراق والأنسجة الكاملة الأخرى.

هذه التقنية قابلة للتطبيق على الدراسات التي تبحث في تنظيم التخليق الحيوي وتوزيع القطن والسوبرين في النباتات العليا.