الفرز الفائق للإرث القائم على البروتين في سيريفيسيا س.

الهدف العام من هذا التنميط الظاهري للخميرة عالي الإنتاجية هو فحص البروتينات التي تحظر ذاكرة نمطية دائمة للتعبير الذي تم تمريره ، كبديل للوراثة القائمة على البروتين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخميرة Prion ، مثل عدد البروتينات التي يمكن أن تتسبب في الوراثة غير المشروعة من هذا النوع. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك فحص العديد من البروتينات والمسارات بطريقة غير متحيزة.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق زراعة خلايا الخميرة المناسبة في صفيحة بئر 96 عند 30 درجة مئوية ، كما هو موضح في بروتوكول النص. افحص الثقافات بصريا للتأكد من أن الثقافات مشبعة ، ويجب أن تكون الخلايا مرئية بالعين ، في قاع كل بئر. استخدم روبوت مناولة السوائل لتحضير 384 لوح بئر ، تحتوي على 45 ميكرولترا من الوسط المناسب لكل بئر.

أولا ، قم بتوزيع Scal-URA في آبار صفيحة 384 بئر. ثم قم بتوزيع Scal-URA بالإضافة إلى الضغوطات ذات الأهمية في آبار اللوحة الثانية ، يتم استخدام 20 ملليمولار من كلوريد المنغنيز كعامل ضغط في هذه التجربة. ثالثا ، قم بتوزيع SD-URA ، الذي لن يحفز التعبير عن البلازميد ، بالإضافة إلى كلوريد المنغنيز في صفيحة أخرى.

قم بخفض لوحة البئر 96 التي تحتوي على الثقافات على روبوت مناولة السوائل وقم بتلقيح مجموعة من واحد إلى أربعة ميكرولتر واحد من كل بئر من لوحة البئر 96 ، في أربعة آبار منفصلة من كل لوحة بئر 384 مملوءة بوسائط مختلفة. ضع الألواح على الفور مع الخلايا على مكدس صفيحة دقيقة في درجة حرارة الغرفة وثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي. اضبط البروتوكول على حلقة متواصلة مدتها 72 ساعة ، وقم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة.

بعد قياسات النمو ، قم بنقل ميكرولتر واحد لكل بئر من الثقافات المستحثة SCal-URA التي عانت من الإفراط في التعبير عن البروتين إلى 384 لوحة بئر جديدة ، تحتوي على 45 ميكرولترا لكل بئر من وسط ST-URA الذي لا يسمح بالتعبير البروتيني عن البلازميد. في موازاة ذلك ، قم بإجراء تطعيمات مماثلة لمجموعة ثانية من 384 صفيحة بئر تحتوي على 45 ميكرولترا لكل بئر من ST-URA من الثقافات التي نمت في ST-URA في وجود الضغوط. ضع الصفائح في غرفة رطبة وقم بتنمية الألواح لمدة 48 ساعة عند 30 درجة مئوية حتى التشبع.

بعد 48 ساعة ، استخدم الألواح لإعادة تلقيح ميكرولتر واحد لكل بئر في 384 لوحا جيدا تحتوي على 45 ميكرولتر لكل بئر من ST-URA. بعد ذلك ، قم بإجراء إعادة تلقيح منفصلة لميكرولتر واحد لكل بئر من نفس لوحة المصدر في صفيحة بئر منفصلة 384 تحتوي على 45 ميكرولترا لكل بئر من ST-URA مع عامل الضغوط. ضع اللوحات على الفور مع خلايا microstacker في درجة حرارة الغرفة وثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي واضبط البروتوكول على حلقة مستمرة مدتها 48 ساعة ، وقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.

عند اكتمال قياسات النمو ، استخدم برنامج قارئ اللوحة لتصدير الوقت مقابل الكثافة الضوئية عند قياسات 600 نانومتر كجدول XY. تجميع أعمدة قياسات الكثافة الضوئية لكل بيولوجية تتكاثر معا وتحسب المتوسط. قم بإنشاء مخطط XY للوقت مقابل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر لإنشاء منحنيات النمو.

بالنسبة للثقافات التي اختارت اختلافات كبيرة في النمو استجابة لضغط معين ، اعتمادا على الإفراط في التعبير عن بروتين الأجداد ، خذ ميكرولتر واحد من كل تكرار بيولوجي ، وخففه في 10 مل من الماء ثم طبق 50 ميكرولترا على أطباق تحتوي على 5-FOA. تنمو عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. إذا أدى ذلك إلى عدد كبير جدا أو عدد قليل جدا من المستعمرات لكل طبق ، فاضبط عامل التخفيف وفقا لذلك.

100 إلى 200 مستعمرة لكل طبق مثالية. اختر ثماني إلى 32 مستعمرة مفردة باستخدام أعواد أسنان الأوتوكلاف وقم بتثبيتها على 96 لوحا جيدا تحتوي على 150 ميكرولترا من SDCSM لكل بئر. ضع الصفائح في غرفة رطبة وتنمو إلى التشبع لمدة 48 إلى 72 ساعة عند 30 درجة مئوية.

استخدم هذه الثقافات لتلقيح مجموعتين جديدتين من 96 لوحا جيدا تحتوي على 150 ميكرولترا لكل بئر من SDCSM ، مع وبدون الضغوط. ضع الألواح على مكدس صفيحة دقيقة واضبط البروتوكول لقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر على حلقة مستمرة مدتها 48 ساعة. بعد 48 ساعة ، قم بتحليل البيانات كما هو موضح سابقا وتأكد من الحفاظ على اختلافات النمو الكبيرة التي شوهدت سابقا بعد فقدان البلازميد.

ثم يتم اختبار الخلايا التي تحافظ على الأنماط الظاهرية المستحثة بحثا عن السمات المميزة الكلاسيكية للوراثة القائمة على البروتين كما هو موضح في بروتوكول النص. كشفت شاشة الوراثة القائمة على البروتين عن الإفراط في التعبير العابر لإطار القراءة المفتوح PSP1 ، مما يؤدي إلى مقاومة كلوريد المنغنيز التي تم الحفاظ عليها لمئات الأجيال في الخلايا ، بعد فترة طويلة من توقف الإفراط في التعبير. سجلت خوارزميات التنبؤ ببريون النهاية ل PSP1 على أنها تشبه بريون إلى حد ما.

في المقابل ، تتنبأت الخوارزميات تقريبا بعدم وجود ميزات تسلسل مهمة تشبه البريون من معظم البروتينات المحفزة التي تم استردادها على الشاشة ، كما هو موضح في هذا التحليل التمثيلي. أشارت قياسات نمو السلالات و SDCSM مع كلوريد المنغنيز ، والتي تم تطبيعها إلى PSP1 ساذج مقابل تحكم ناقص ، إلى أن تثبيط تفكيك HSP104 لا يضعف مقاومة كلوريد المنغنيز المعتمد على PSP1 في حين أن إزالة مرافق HSP70 وجين PSP1 ، يزيل هذا النمط الظاهري وراثيا. تظهر جميع الجراثيم من رباعي الصلبان المفردة بين السلالات ، والتي تؤوي حالة النمط الظاهري المعتمدة على PSP1 والسلالات الساذجة ، مقاومة كلوريد المنغنيز ، مما يشير إلى الوراثة غير المندلية للنمط الظاهري.

أظهرت مقارنة بين العدوى لتحويل البروتين بين المحللات الوهمية و PSP1 التي تؤوي المحللات كمادة قابلة للانتقال ، أن أكثر من 53٪ من الخلايا الساذجة التي تحولت باستخدام PSP1 المصنف ، تلقت النمط الظاهري المقابل لمقاومة كلوريد المنغنيز. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسبوعين ، بما في ذلك خطوات الحضانة ويمكن إعداد معظم خطوات الفحص في أقل من ساعتين يوميا ، حتى مع وجود عدد كبير من اللوحات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التخطيط بالضبط لما تريد اختباره مسبقا وأن تضع في اعتبارك حجم التجربة.

الآن هذا مهم بشكل خاص للمبتدئين في هذه التقنية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تلك الموضحة في بروتوكول النص لتحديد ما إذا كانت الأنماط الظاهرية التي لوحظت في الفحص تعرض نمطا حقيقيا يشبه البريون من الوراثة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم التخلق لاستكشاف اتساع بيولوجيا البريون في خدمة العجز CI.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم شاشة عالية الإنتاجية لأشكال جديدة من الوراثة القائمة على البروتين في الخميرة ، بطريقة غير متحيزة ومستهدفة.

لا تنس أن بعض الضغوطات الكيميائية مثل العوامل الضارة بالحمض النووي يمكن أن تكون خطيرة للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.