فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض التنكسية العصبية ، مثل العوامل والمسارات الوراثية التي تنظم سمية البروتينات المرتبطة بالأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن عملية تزاوج الخميرة عالية الكفاءة تستخدم لفحص نماذج الخميرة مقابل مجموعة كبيرة من جينات المكتبة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لسمية بروتينات الأمراض التنكسية العصبية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسة العمليات الخلوية الأخرى في الخميرة ، مثل تحمل ظروف الإجهاد الأخرى.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق نقل خمسة ميكرولترات لكل بئر من الحمض النووي البلازميد من مكتبة بلازميد مصفوفة إلى ألواح 96 بئرا مستديرة. احتفظ بالصفائح عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتلقيح 150 مل من سكر العنب ببتون الخميرة أو وسط YPD في قارورة سعة 500 مل بمستعمرة من سلالة الخميرة أحادية الصيغة الصبغية W303 Alpha.

احتضان المزرعة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، بعد قياس OD600 من الثقافة الليلية ، قم بتخفيف المزرعة إلى OD600 من 0.1 في لترين من YPD. احتضان عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة خمس ساعات تقريبا ، حتى تصل المزرعة إلى OD600 من 0.4 إلى 0.6.

لحصاد ثقافة الخميرة ، املأ ثماني زجاجات طرد مركزي معقمة سعة 250 مليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 3000 × جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اسكب المادة الطافية دون تعطيل الحبيبات. اغسل الخميرة كما هو موضح في بروتوكول النص ، وقم بدمج الخلايا في أنبوبين للطرد المركزي.

أعد تعليق كل حبيبات خلية في 25 مل من محلول أسيتات الليثيوم 0.1 مولار. امزج الخلايا المعلقة ، وأضف خمسة ملليلتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون ، وانقلها إلى قارورة سعة 150 ملليلترا. احتضان عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، صب خليط الخلية في خزان كاشف معقم يمكن التخلص منه. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 35 ميكرولترا من خليط الخلية إلى كل بئر من الألواح المستديرة القاعية المكونة من 96 بئرا، والتي تحتوي على الحمض النووي البلازميد للمكتبة المحضر مسبقا. دوامة الألواح المكونة من 96 بئرا عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة.

احتضان الصفائح على حرارة 30 درجة مئوية دون رجها لمدة 30 دقيقة. لا تقم بتكديس الألواح ، حتى تنتقل الحرارة بشكل أكثر كفاءة. قم بإزالة الألواح المكونة من 96 بئرا من الحاضنة 30 درجة مئوية واخلطها عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.

أضف 125 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتحويل إلى كل بئر ، ثم قم بتدوير الألواح بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. احتضن الألواح على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم صدم الخميرة بالحرارة عن طريق وضع الألواح في حاضنة 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

الطرد المركزي الألواح عند 3000 xG لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المخزن المؤقت للتحويل من الآبار عن طريق قلب الألواح فوق سلة النفايات وإلقاء المخزن المؤقت بقوة من الألواح. امسح الألواح المقلوبة بسرعة على منشفة ورقية نظيفة لإزالة أي سائل أعلى الألواح.

اشطف الخلايا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من وسط التسرب الأدنى المقابل للعلامة القابلة للتحديد على بلازميد المكتبة. يتم استخدام الوسط الاصطناعي ناقص هنا. الطرد المركزي الألواح عند 3000 xG لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية فوق سلة المهملات كما هو موضح سابقا. أضف 160 ميكرولترا من الحد الأدنى من المتوسط ناقص ، يحتوي على 2٪ جلوكوز لكل بئر وقم بتدوير الألواح عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. احتضن الألواح دون رج عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

بعد 48 ساعة ، يجب أن تكون حبيبات الخميرة المحولة مرئية في قاع كل بئر. باستخدام موزع سائل ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط ناقص اليورا الذي يحتوي على الجلوكوز في كل بئر من مجموعة جديدة من 96 بئرا من الأطباق. دوامة الصفائح التي تحتوي على الخميرة المحولة عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.

باستخدام مكرر بلاستيكي معقم مكون من 96 سنا ، ضع المسامير في الآبار التي تحتوي على الخميرة المحولة ثم قم بتلقيحها في الآبار المقابلة للألواح الجديدة المملوءة بالوسائط. احتضان الألواح الجديدة عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، يجب أن تكون حبيبة الخميرة مرئية في قاع كل بئر تحتوي على خميرة محولة بنجاح.

لحفظ سلالات الخميرة هذه كمخزون من الجلسرين ، أضف 50 ميكرولترا من 50٪ من الجلسرين إلى كل بئر ، وقم بتدوير الألواح عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، وأغلق الألواح بورق الألمنيوم ، وقم بتجميدها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لإحياء سلالات المكتبة من مخزون الجلسرين ، أخرج الألواح المكونة من 96 بئرا من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وقم بإزالة ورق الألمنيوم ، واترك الخميرة تذوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا. بمجرد ذوبان الخميرة ، استخدم مكررا بلاستيكيا معقما 96 دبوسا لتلقيح مخزون الجلسرين إلى 160 ميكرولتر من أورا طازجة ناقص وسائط تحتوي على 2٪ جلوكوز في ألواح 96 بئرا واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

مباشرة بعد استخدام سلالات المكتبة ، أغلق الألواح ، وأعدها إلى الفريزر الذي تبلغ درجة حرارته تحت الصفر 80 درجة مئوية. في نفس اليوم الذي يتم فيه إذابة سلالات المكتبة ، قم بتلقيح سلالة خميرة الاستعلام في 50 مل من YPD وتنمو عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، اسكب سلالة خميرة الاستعلام في خزان كاشف معقم يمكن التخلص منه وقم بتناول 160 ميكرولترا من سلالة الاستعلام لكل بئر من لوحة 96 بئرا.

باستخدام موزع السوائل ، قم بتوزيع 160 ميكرولتر لكل بئر من وسائط YPD في ألواح 96 بئرا. قم بدوامة الألواح المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على سلالة الاستعلام وألواح إجهاد المكتبة لفترة وجيزة ثم استخدم مكررا معقما مكون من 96 سنا لنقل سلالات المكتبة إلى لوحات YPD التي تم تلقيحها بسلالة الاستعلام. احتضان ألواح YPD عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

بعد 24 ساعة ، ستظهر حبة من الخميرة في قاع كل بئر. املأ الألواح المكونة من 96 بئرا بالحد الأدنى من وسط التدلي الذي يحتوي على 2٪ رافينوز المقابل للعلامات القابلة للتحديد على البلازميد في سلالة الاستعلام ، وكذلك على بلازميد المكتبة. استخدم مكررا معقما من 96 سنا لنقل الخميرة من مزارع التزاوج YPD إلى الوسط الانتقائي.

احتضان الألواح المكونة من 96 بئرا عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. فقط خلايا الخميرة التي تزاوجت وشكلت خلايا ثنائية الصبغيات وبالتالي تحتوي على كل من بلازميد الاستعلام وبلازميد المكتبة ستكون قادرة على النمو في هذا الوسط. بعد 48 ساعة من النمو في الرافينوز الذي يحتوي على وسط انتقائي ، لاحظ أن الحبيبات مرئية في قاع الآبار التي تحتوي على خلايا ثنائية الصبغيات.

دوامة الألواح المكونة من 96 بئرا عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. استخدم آلة اكتشاف روبوتية لاكتشاف الخميرة على ألواح أجار في أربع مرات إلى ألواح ura-his-duupout تحتوي على 2٪ galactose و 2٪ agar ، وإلى ألواح ura-his-droupout التي تحتوي على 2٪ جلوكوز و 2٪ أجار. بعد الإكتشاف ، اترك ألواح الأجار تجف ثم ضعها رأسا على عقب في حاضنة 30 درجة مئوية لمدة أربعة أيام.

كل 24 ساعة ، قم بتصوير ألواح الأجار لتسجيل نمو الخميرة. تم فحص سمية البروتين المرتبط بمرض التصلب الجانبي الضموري FUS لأول مرة في الخميرة ثنائية الصبغيات. كما هو موضح في صفيحة أجار التي تحتوي على الجالاكتوز ، مما يؤدي إلى FUS ، فإن سمية FUS متسقة في كل من الخميرة ثنائية الصيغة الصبغية والخميرة أحادية الصيغة الصبغية.

تم اختبار خمسة جينات تم تحديدها سابقا على أنها مثبطات لسمية FUS من طريقة قائمة على التحويل بطريقة التزاوج. الممر الأول عبارة عن سلالة خميرة تحكم تحولت بمتجهين فارغين. الممر الثاني هو سلالة خميرة FUS ثنائية الصبغيات مع متجه فارغ حيث يكون التعبير عن FUS شديد السمية.

تظهر الممرات من ثلاثة إلى سبعة خميرة ثنائية الصبغيات تعبر عن FUS بالإضافة إلى جين قمع. تنقذ جميع الجينات الخمسة سمية FUS في الخميرة ثنائية الصبغيات ، مما يشير إلى أن طريقة التزاوج كانت فعالة. ثم تم تطبيق هذه الطريقة القائمة على التزاوج على فحص مكتبة الإفراط في التعبير ل 940 جينا.

وتظهر صورة للوحة تمثيلية واحدة. كما هو موضح في صفيحة الجالاكتوز ، حيث يتم التعبير عن FUS وجينات المكتبة ، كانت FUS سامة لخلية الخميرة ثنائية الحجم. أنقذ جين المكتبة ، المشار إليه بالمربع الأخضر ، سمية FUS.

بينما عزز جين المكتبة ، المشار إليه بالمربع الأحمر ، السمية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 120 ساعة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق مسبقا من أن النمط الظاهري المستخدم للفحص لا يعتمد على نوع التزاوج أحادي الصيغة الصبغية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد العوامل الوراثية عند الإفراط في التعبير التي تنقذ سمية البروتينات المرتبطة بالأمراض في الخميرة. بعد تطويرها ، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال الأمراض التنكسية العصبية ، لاستكشاف آليات السمية الخلوية للبروتينات المرتبطة بالمرض في نموذج الخميرة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل اختبار بيتا جالاكتوزيداز من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما إذا كان الإنقاذ محددا.