إعداد شرائح الدماغ الحادة باستخدام محسن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني

يوضح هذا البروتوكول تنفيذ الأمثل N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني (نمدج) من إعداد شريحة الدماغ. يتم استخدام صيغة وسائط واحد موثوق بها الحصول على شرائح المخ السليمة من الحيوانات من أي سن وتطبيقات تجريبية متنوعة.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير شرائح دماغ صحية من البالغة الناضجة المناسبة لتجارب الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح. لذا فإن طريقة الاسترداد الوقائية NMDG المحسنة لإعداد شريحة الدماغ تسمح للباحثين باستكشاف الخصائص الجوهرية والمشبكية لأنواع خلايا الدماغ عبر العديد من مناطق الدماغ المختلفة وللحيوانات في أي عمر تقريبا. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية بالذات هي أنها تسمح للمرء بإعداد شرائح الدماغ التي لديها درجة أعلى من الحفاظ على الخلايا العصبية مقارنة بالمنهجيات السابقة.

وأيضا أن شرائح الدماغ هذه أكثر ملاءمة لتسجيل مشبك التصحيح. تم تحسين هذه الطريقة لأنسجة دماغ الفئران البالغة. يمكن استخدامه لمجموعة متنوعة من الأنواع الأخرى بما في ذلك أنسجة المخ البشري التي تم استئصالها جراحيا عصبيا.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد محطة التقطيع باستخدام آلة تقطيع الأنسجة والأدوات الجراحية. قم بتوصيل شفرة حاقن سيراميك الزركونيوم بذراع الشفرة باستخدام غراء لاصق سريع. ثم أدخل حامل العينة وقم بمحاذاة الحافة الأمامية للشفرة مع حافة حامل العينة.

ترك فجوة صغيرة للتأكد من أن الشفرة لا تكشط المعدن. املأ دورق سعة 250 مل ب 200 مل من NMDG HEPES aCSF. وقم بتبريده مسبقا على الثلج مع الكربوجين المستمر لأكثر من 10 دقائق.

ثم قم بإعداد غرفة استرداد شريحة الدماغ الأولية عن طريق ملئها ب 150 مل من NMDG HEPES aCSF. وضع الغرفة في حمام مائي على حرارة 32 إلى 34 درجة مئوية. لإعداد غرفة تثبيت شريحة دماغية ، املأ الخزان ب 450 مل من HEPES aCSF واتركه دافئا إلى درجة حرارة الغرفة تحت كربوجين مستمر حتى الاستخدام.

بعد ذلك ، قم بإعداد الاغاروز المنصهر لتضمين الأنسجة عن طريق قطع كتلة من 2٪ agarose من الطبق المعد مسبقا باستخدام الطرف المفتوح لقارورة مخروطية سعة 50 مل. قم بتغطية القارورة المخروطية بشكل غير محكم ثم ضعها في الميكروويف لمدة 10 إلى 30 ثانية حتى يبدأ الاغاروز في الذوبان. لا تسخن.

صب الاغاروز المنصهر في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. حافظ على الاغاروز في الحالة المنصهرة باستخدام خلاط حراري مضبوطة على 42 درجة مئوية مع اهتزاز قوي. وتأكد بعناية من أن الاغاروز المنصهر لا يتجمد قبل الأوان.

قم بتبريد كتلة التبريد الملحقة مسبقا للقطاعة على الجليد في هذا الوقت. في هذا الإجراء ، قم بعمل قطع على جلد الرأس لفضح القلنسوة. ثم استخدم مقصا فائق القطع ناعما لقطع الجلد فوق قلنسوة.

وقم بعمل شقوق صغيرة بشكل جانبي القاعدة البطنية الذيلية للجمجمة. قم بعمل قطع ضحلة إضافية بدءا من الجانب الظهري الذيلي للجمجمة تتحرك في الاتجاه المنقاري حتى خط الوسط الظهري. الحرص على عدم إتلاف الدماغ الأساسي.

بعد ذلك ، قم بعمل قطع T نهائي عموديا على خط الوسط على مستوى المصابيح الشمية. بعد ذلك ، استخدم ملقط الطرف المستدير للإمساك بالجمجمة بدءا من الجانب الإنسي المنقاري وقشر باتجاه الاتجاه الجانبي الذيلي على جانب واحد. كرر هذا الإجراء حتى ينفتح الجانب الآخر.

وإزالة النصفين الظهريين من غطاء الجمجمة لفضح الدماغ. استخرج الدماغ السليم برفق في دورق NMDG HEPES aCSF المبرد مسبقا. واسمح للدماغ أن يبرد بشكل موحد لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

الآن ، استخدم ملعقة كبيرة لنقل الدماغ من الدورق إلى طبق بتري المغطى بورق الترشيح. قم بقص الدماغ وتركيبه وفقا لزاوية التقطيع المفضلة ومنطقة الدماغ المرغوبة ذات الاهتمام. اعمل بسرعة لتجنب الحرمان من الأكسجين لفترات طويلة أثناء المناولة.

بعد ذلك ، قم بلصق كتلة الدماغ على حامل العينة باستخدام الغراء اللاصق. اسحب القطعة الداخلية لحامل العينة لسحب كتلة الدماغ بالكامل من الداخل. ثم صب الاغاروز المنصهر مباشرة في الحامل حتى يتم تغطية كتلة الدماغ بالكامل في الاغاروز.

بعد ذلك ، قم بتثبيت كتلة التبريد الملحقة المبردة مسبقا حول حامل العينة لمدة عشر ثوان حتى يتجمد الاغاروز. أدخل حامل العينة في الوعاء الموجود على آلة التقطيع وتحقق من المحاذاة المناسبة. بعد ذلك ، املأ الخزان بما تبقى من NMDG HEPES aCSF المبرد مسبقا من دورق 250 مليلتر وضع حجر الفقاعة في الخزان طوال مدة التقطيع ، لضمان الأكسجين الكافي.

بعد ذلك ، اضبط الميكرومتر لبدء تطوير عينة الدماغ المضمنة في الاغاروز. ابدأ تشغيل القطاعة واضبط سرعة التقدم وتردد التذبذب تجريبيا إلى المستوى المطلوب. استمر في التقدم وتقطيع الأنسجة بزيادات قدرها 300 ميكرومتر حتى يتم تقسيم منطقة الدماغ محل الاهتمام بالكامل.

يجب أن يكون الوقت الإجمالي لإجراء التقطيع أقل من 15 دقيقة. للتعافي الأولي من NMDG. عند الانتهاء من إجراء التقسيم ، اجمع جميع الشرائح باستخدام ماصة مرعى بلاستيكية مقطوعة ونقلها إلى غرفة استرداد 34 درجة مئوية مملوءة ب 150 مل من NMDG HEPES aCSF.

توقيت خطوة التعافي الحادة من شريحة الدماغ مهما جدا لتكون قادرا على تحقيق توازن بين الحفظ المورفولوجي والاستعادة الوظيفية للخصائص الفيزيولوجية الكهربية لكل خلية عصبية. بعد تحديد الجدول الزمني الأمثل لارتفاع الصوديوم ، وفقا لعمر الفأر ، قم بتنفيذ إجراء ارتفاع الصوديوم في الخطوة Y عن طريق إضافة الأحجام المحددة لمحلول ارتفاع الصوديوم في الأوقات المحددة. أضف محلول ارتفاع الصوديوم مباشرة إلى مدخنة الفقاعات لغرفة الاسترداد الأولية لتسهيل الخلط السريع.

يعد جدول ارتفاع الصوديوم الذي تم توفيره مع مجموعة متنوعة من الفئات العمرية المختلفة نقطة انطلاق جيدة حقا. ولكن يجب تحسينه واستخدامه لتصميمك التجريبي المحدد. بعد ذلك ، انقل جميع الشرائح إلى غرفة التثبيت طويلة الأجل HEPES aCSF التي يتم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة.

اسمح للشرائح بالتعافي لمدة ساعة أخرى في غرفة الاحتفاظ ب HEPES قبل تجارب تسجيل مشبك التصحيح. تظهر هنا صور IR DIC التمثيلية التي تم الحصول عليها من مناطق دماغية متنوعة وشرائح حادة من فأر يبلغ من العمر ثلاثة أشهر لتقييم الحفاظ المورفولوجي على الخلايا العصبية. النتائج الموضحة هنا هي من استخدام طريقة القطع الواقية NMDG للتحكم دون خطوة استرداد وقائية.

في حين أن هذه النتائج مأخوذة من طريقة الاسترداد الوقائي NMDG المحسنة. بشكل عام ، لوحظ تحسين الحفاظ على الخلايا العصبية باستخدام طريقة الاسترداد الوقائية NMDG المحسنة. تمت مقارنة طريقة الاسترداد الوقائية NMDG المحسنة مع إجراء ارتفاع الصوديوم التدريجي مع طريقة الاسترداد الوقائية NMDG الأصلية.

تم تقليل متوسط الوقت لتشكيل ختم GigaOhm وتسجيل مشبك التصحيح بشكل كبير وكبير عندما تم تطبيق إجراء ارتفاع الصوديوم التدريجي جنبا إلى جنب مع خطوة الاسترداد الوقائي NMDG. يسهل الحفاظ المحسن على الخلايا العصبية التي تم تحقيقها باستخدام طريقة شريحة الدماغ هذه التطبيقات التجريبية الصعبة بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح متعدد الأقطاب الكهربائية لاستكشاف الاتصال المشبكي المحلي. كما هو موضح هنا ، باستخدام شرائح الدماغ القشرية الحديثة للإنسان البالغ المشتقة من جراحة الأعصاب.

يجب أن يكون لدى العلماء فهم جيد من مشاهدة هذا الفيديو حول كيفية تنفيذ طريقة الاسترداد الوقائية NMDG المحسنة بما في ذلك إجراء ارتفاع الصوديوم الجديد الذي وصفناه ، لإعداد شرائح الدماغ المناسبة لتسجيلات مشبك التصحيح. لذلك بعد إتقان هذا البروتوكول ، يجب أن يكون من الممكن إكمال إجراء شريحة الدماغ في أقل من ساعة واحدة كل يوم. ويجب أن تنتج شرائح دماغ عالية الجودة قابلة للتكرار وستعمل مع في أي عمر تقريبا.

لذلك ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في إعداد شرائح الدماغ المناسبة لمعالجة الأسئلة المتعلقة بوظائف المخ باستخدام تقنيات مثل الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير البصري الحي وعلم البصريات الوراثي ومقايسات الاتجار بالمستقبلات وأنواع أخرى من المقايسات الوظيفية لاستكشاف وظيفة أنواع خلايا الدماغ. لذا فإن هذه التقنية مفيدة أيضا لأنها ستساعد الباحثين على أن يكونوا قادرين على التحقيق الوظيفي في مناطق الدماغ المختلفة بما في ذلك مناطق الدماغ التي لا يمكن استخدامها تقليديا لتسجيل مشبك التصحيح من البالغة في شرائح الدماغ.