وظيفية تحليل التكملة (FCA): ممارسة مختبر تصميم وتنفيذ المكمل لتدريس الكيمياء الحيوية مسارات

العام من مقال التكميل الوظيفي هو توضيح نشاط الإنزيم عن طريق إدخال نسخة وظيفية من الجين المقابل في خلية متحولة لمعرفة ما إذا كان يعيد نمطا ظاهريا من النوع البري في الخلفية الطافرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجموعة متنوعة من المجالات ، مثل الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الدقيقة وعلم الوراثة وبيولوجيا النبات والتطور وغيرها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقيم وظيفة الإنزيم ونشاطه و / أو دوره ، في ظل ظروف في الجسم الحي ، والتي عادة ما تكون فسيولوجية بطبيعتها ، على عكس الظروف المختبرية ، والتي عادة ما تكون اصطناعية بطبيعتها.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تحديد و / أو توضيح وظيفة الإنزيمات غير المميزة ، وتلك التي لا تزال لها وظائف مفترضة أو متوقعة. إثبات هذا الإجراء من التكامل الوظيفي هو تخصص التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية الجزيئية ، تايلور هاركنيس ، طالب في مختبري. بعد استنساخ جينات DapL و TarB و MurE و RSH وفقا لبروتوكول النص ، قم بتلقيح 50 مل من الوسط السائل بمستعمرة واحدة من الخلايا البكتيرية الطافرة ليتم تحويلها بجين ذي أهمية وتنمو بين عشية وضحاها.

في اليوم الثاني ، استخدم 50 مليلتر المزرعة الليلية لتلقيح 1 لتر من الوسط المناسب وتنمو عند 30 درجة مئوية لمرحلة القفل ، أو إلى OD600 من 0.4 إلى 0.6. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5،000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم صب المادة الطافية واستخدم 500 مل من الماء المقطر المعقم والمثلج لتعليق الحبيبات.

الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، وبعد صب المادة الطافية ، استخدم 250 مل من الجلسرين المعقم البارد بنسبة 10٪ لتعليق الحبيبات. بعد تدوير الخلايا للمرة الأخيرة ، استخدم ملليلترين من الجلسرين بنسبة 10٪ لإعادة تعليق الخلايا. انقل 50 ميكرولتر إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وقم بتجميدها على الفور عن طريق وضع الأنابيب في حمام الإيثانول الثلجي الجاف.

قم بتخزين الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للتثقيب الكهربائي. لإجراء التثقيب الكهربائي ، أضف 1 ميكرولتر من البلازميد المؤتلف إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة وضعها على الجليد لمدة خمس دقائق. انقل الخلايا إلى كوفيت التثقيب الكهربائي واضبط جهاز التثقيب الكهربائي على الإعدادات التالية: سعة 25 درجة فهرنهايت ، 2.5 كيلو فولت ، ومقاومة 200 أوم.

ثم مع وجود الكوفيت في الجهاز ، قم بتوصيل نبضة. أضف 1 مليلتر من وسط الاسترداد إلى الكوفيت وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. اسمح للخلايا بالتعافي عن طريق احتضان المزرعة في حاضنة اهتزاز مع دوران لطيف لمدة 60 دقيقة عند درجة الحرارة المناسبة التي يتطلبها المتحول.

لاختيار المحولات، قم بوضع 100 ميكرولتر من المزرعة على وسط باستخدام ألواح أجار واستخدم موزعة معقمة لنشر المحلول. ثم احتضن طوال الليل في درجة الحرارة المناسبة. راجع بروتوكول النص لمزيد من التفاصيل.

لإجراء تحليل التكميل ، قم بتحويل AOH1 باستخدام المتجه الفارغ pBAD33 أو باستخدام متجهات التعبير dapL باستخدام التثقيب الكهربائي ، كما هو موضح للتو. قم بلوحة خليط التحويل على وسط أجار LB ، مع استكمال 50 ميكروغراما لكل مليلتر من Dap ، و 34 ميكروغراما لكل ملليلتر من الكلورامفينيكول ، و 50 ميكروغراما لكل مليلتر من الكاناميسين. احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل ملاحظة النتائج.

باستخدام المتجه الفارغ pBAD33 أو مع متجه التعبير عن murE ، قم بتحويل متحولة TKL-11 باستخدام التثقيب الكهربائي كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. قم بوضع المحولات على أجار LB ، مع استكمالها ب 50 ميكروغراما لكل مليلتر من الثيامين ، و 34 ميكروغراما لكل مليلتر من الكلورامفينيكول ، واحتضان الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل التحقق من وجود محولات. اختبر التكامل عن طريق خطوط أو طلاء المستعمرات من كل من التحولات الضابطة والتجريبية على لوحين من وسط LB ، بالإضافة إلى 0.2٪ أرابينوز ، و 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الثيامين.

احتضان صفيحة واحدة عند 30 درجة مئوية والأخرى عند 42 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل تقييم النمط الظاهري للنمو. قم بتحويل سلالة Hx699 الطافرة وسلالة Rr217 من النوع البري من أنواع novosphingobium باستخدام المتجه الفارغ pRK290 ، أو ناقل يحتوي على جين rshNsp الأصلي في حدثي تحويل منفصلين لكل منهما ، كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. ضع المحولات على سكر العنب البطاطس أو PD أجار مع 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من التتراسيكلين واحتضانها لمدة 72 ساعة على الأقل ، أو حتى تظهر المحولات.

بعد ذلك ، قم بربط المحولات بنمط X على ألواح أجار PD الجديدة باستخدام التتراسيكلين. بعد الحضانة عند 30 درجة مئوية لمدة أربعة أيام على الأقل ، افحص بصريا النمط الظاهري للنمو لكلا اللوحين يحتوي الإشريكية القولونية المزدوجة AOH1 على طفرة في جين DapE ، وحذف جين DapD ، ولن ينمو ما لم يتم توفير Dap.

كما هو موضح هنا ، فإن طفرة AOH1 التي تعبر عن DapLs قادرة على النمو على وسيط خال من LLDap عن طريق تحويل THDP إلى LLDap في مسار Dap lyse. يسهل إنزيم MurE إضافة m-DAP إلى الببتيدوغليكان للبكتيريا سالبة الجرام. لا يمكن أن ينمو طفرة الإشريكية القولونية MurE ، TKL-11 ، عند 42 درجة مئوية.

في هذه التجربة ، تنمو خلايا TKL-11 فقط التي تحولت مع MurE عند 42 درجة مئوية. تمنع الطفرة في جين TyrB تخليق التيروزين والفينيل ألانين. ومع ذلك ، كما هو موضح هنا ، عندما تعبر سلالة DL39 المتحولة TyrB عن جين A.thaliana At5g36160 ، فإنها تنمو على وسط M9 ، وتفتقر إلى التيروزين والفينيل ألانين ، مما يدل على أن الإنزيم يمكنه تصنيع التيروزين.

يحتوي طفرة Hx699 في أنواع novosphingobium على بروتين RSH غير وظيفي وينتج نمطا ظاهريا ناقص المخاطية. ومع ذلك ، فإن التحول مع جين RSH الأصلي ينتج عديدات سكاريد خارج الخلية أكثر قابلية للذوبان في الخط X متعدد الخلايا الذي يكون مفرط المخاطية. في المقابل ، عندما يتم تحويل طفرة Hx699 بناقل فارغ ، فإنها تنتج نمطا ظاهريا ناقص المخاطية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 24 إلى 48 ساعة تقريبا. إذا تم إجراؤه بشكل صحيح ، اعتمادا على نمو الكائن الحي النموذجي المستخدم ، باستثناء الاستنساخ ، وكفاءة خطوات التحضير والتحويل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر متطلبات حالة النمو للطفرات المستخدمة في تحليل التكميل الوظيفي.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التوصيفات البديهية التقليدية في المختبر من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل خصوصية الركيزة ، ودرجة الحرارة ، ودرجة الحموضة المثلى ، ومعدلات السرعة الجسدية ، وما إلى ذلك. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء والعديد من مجالات التقسيم الفرعي ، مثل علم الأحياء الدقيقة ، لتوضيح وظيفة أو دور الإنزيمات من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تكوين خلايا بكتيرية ذات كفاءة كهربائية ، وكيفية تحويل البكتيريا باستخدام التثقيب الكهربائي ، وكيفية تقييم وظيفة الجينات / الإنزيمات باستخدام التكامل الوظيفي.

لا تنس أن العمل مع الكائنات المسببة للأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة.