الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة المتعلقة بتفاعل مسببات الأمراض المضيفة واكتشاف الأدوية ، مثل أهمية عوامل الفوعة المختلفة وقدرة الجزيئات الصغيرة على التحسن مع النشأة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تحدث في شكل سائل بأحجام صغيرة. للبدء ، أثناء العمل داخل خزانة السلامة البيولوجية BSL 2 ، قم بوضع P.aeruginosa من مخزون مجمد على لوحة LB Agar.

احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة ، ثم قم بتخزين الطبق عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. قبل يومين من إعداد لوحات الفحص ، استخدم مستعمرة واحدة من اللوحة لتلقيح ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من مرق LB المعقم. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة.

بعد تحضير وسائط القتل البطيء أو SK وفقا لبروتوكول النص ، مع 350 مل من p. Aeruginosa من ثقافة LB الطازجة بين عشية وضحاها ، قم بزرع كل لوحة SK 10 سم. استخدم موزعا للبكتيريا معقما لنشر البكتيريا بالتساوي ، واترك الألواح تجف في خزانة السلامة الحيوية.

ثم احتضن الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لاختبار سلالات بكتيرية متعددة من الحمض النووي الريبي بالتوازي في بئر واحد من صفيحة بئر بعمق 24 بئرا ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من كل استنساخ من الحمض النووي الريبي المحضر مسبقا المحتوية على بكتيريا في أربعة ملليلتر من الكربينسيلين المكمل LB. ضع الألواح في حاضنة اهتزاز محسنة للألواح متعددة الآبار عند 37 درجة مئوية و 950 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة ، ثم اجمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 2 ، 000 جم لمدة 5 دقائق. صب المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة ورجها بقوة.

باستخدام 100 ميكرولتر من S Basal يعلق بكتيريا الحمض النووي الريبي. ماصة البكتيريا المعلقة في عدد مناسب من الآبار من صفيحة NGM متعددة الآبار مكملة ب IPTG والكاربينيسيلين والسماح للصفيحة بالجفاف. بعد تحضير ديدان L1 وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد أطباق للتجارب الأساسية عن طريق سحب ما يقرب من 5،000 دودة لكل صفيحة 10 سم ، بذرة ب RNAi أو OP50 superfood.

لإعداد شاشة RNAi ، قم بعمل ماصة ما يقرب من 300 دودة لكل بئر في صفيحة 24 بئر مصنفة بالحمض النووي الريبي. إذا كانت السلالة المستخدمة معقمة في درجة الحرارة ، فقم باحتضان الديدان عند 15 درجة مئوية لمدة 16 ساعة تقريبا ثم انقلها إلى 25 درجة مئوية لمدة 44 ساعة لإكمال التطور ومنع التطور الجنيني. لإجراء فحص قتل السائل ، استخدم مكشطة خلية لإزالة P.aeruginosa من صفيحة SK وإعادة تعليق البكتيريا في حوالي 5 ملليلتر من S.Basal.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس OD 600 للتعليق البكتيري. قم بإعداد 24 مل من المخزون المخفف من P.Aeruginosa في S.Basal عند OD 600 يساوي 09 ، ثم أضف 21 مل من وسائط SK السائلة ، وباستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 45 ميكرولترا من البكتيريا والوسائط إلى كل بئر من لوحة 384 بئر. اغسل الديدان من مصدرها في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، واتركها تستقر تحت قوة الجاذبية.

استنشق المادة الطافية إلى 5 ملليلتر ، ثم استخدم ما مجموعه 50 مل من S.Basal لإعادة تعليق الديدان ، وكرر الغسيل مرتين أخريين. باستخدام فارز الدودة ، قم بفرز ما يقرب من 22 دودة في كل بئر من صفيحة 384 بئر ، وفقا لبروتوكول النص ، ثم استخدم طبقة نفاذة للغاز لإغلاق اللوحة واحتضانها عند 25 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة. في الوقت المطلوب ، استخدم غسالة صفيحة دقيقة و S.Basal لغسل لوحة البئر 384 ما مجموعه 5 مرات.

أحد أسهل الأخطاء التي يجب ارتكابها هو شفط صفيحة البئر 384 قبل أن تستقر الديدان تماما. يتطلب الأمر ممارسة لمعرفة ما إذا كانت الديدان قد استقرت تماما أم لا. بعد الغسيل النهائي ، قم بشفط المادة الطافية حتى 20 ميكرولترا.

ثم أضف 50 ميكرولترا من صبغة الحمض النووي 98 ميكرومولار لكل بئر ، للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.7 ميكرومولار. احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 إلى 16 ساعة. بعد فترة الحضانة المطلوبة ، استخدم غسالة الصفيحة الدقيقة لغسل الألواح ثلاث مرات على الأقل.

للحصول على البيانات ، استخدم مقياس الطيف الضوئي أو المجهر الآلي لتصوير كل من الضوء المنقول والفلورة. أضف ملليلتر واحد من S Basal لكل بئر من صفيحة 24 بئرا تحتوي على 300 دودة لكل بئر. حرك الديدان برفق عن طريق هز اللوحة ، ثم انقل الديدان إلى صفيحة فارغة ومعقمة بعمق 24.

اسمح للديدان بالاستقرار بالجاذبية ، حوالي خمس دقائق. استنشق المادة الطافية ، وترك ما يقرب من مليلتر واحد لكل بئر ، ثم أضف 7 ملليلتر من S Basal إلى كل بئر. كرر الغسيل مرتين أخريين ، ثم بعد الغسيل النهائي ، استنشق كل ما عدا حوالي 400 ميكرولتر من المادة الطافية

بعد سحب البكتيريا في 384 لوحة بئر لتجنب الجوع ، باستخدام وظيفة إعادة أخذ العينات لفارز الديدان ، قم بفرز 22 دودة في كل بئر من صفيحة 384 بئر. أخيرا ، بعد الفرز ، أضف جزيئات صغيرة أو مواد أخرى محددة للتجربة. كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، عند اتباع الخطوات الموضحة في هذا الفيديو ، لن يلاحظ قتل C.elegans المعتمد على الوقت إلا في وجود P.aeruginosa.

في المقابل ، في حالة عدم وجود مكملات غذائية بكتيرية رئيسية ، لن يلاحظ سوى القليل من القتل. كما هو موضح هنا ، فإن الحضانة المكونة من خطوتين ل P.aeruginosa عند 37 درجة مئوية ثم 25 درجة مئوية ، وهو أمر بالغ الأهمية لمقايسات القتل البطيء التقليدية ، وتم تنفيذه في الأصل في قتل السوائل ، يمكن الاستغناء عنه في هذا الفحص. يتسامح البروتوكول مع مجموعة واسعة من التركيزات البكتيرية الأولية ، من OD 600 يساوي 0025 ، ولا يزال يظهر قتلا يعتمد على الوقت والتركيز ، على الرغم من أن التوقيت يتغير.

بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون ما لا يقل عن أربعة آبار كافيا للحصول على بيانات ذات دلالة إحصائية. يظهر هنا مثال على فائدة المعالجة عندما تكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية ، كما في هذا المثال ، يكون التحليل بسيطا والتمييز بين الشروط الإيجابية والسلبية تافه. في هذه الحالات ، يمكن التعرف بسهولة على الضربات الضعيفة.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في حوالي 60 إلى 75 دقيقة من اليد في الوقت المحدد لكل 384 لوحة بئر ، لا تشمل الفرز. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من الأهمية بمكان أن تتذكر إضافة جميع المكونات إلى الوسائط الخاصة بك وإلا ستتعرض الفوعة للخطر. يبسط هذا الاختبار تطبيق الفحص القائم على النمط الظاهري للكائن الحي الكامل لاكتشاف الأدوية في أبحاث مسببات الأمراض المضيفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحوصات التسبب في الإصابة ب C elegans القائمة على السائل. يمكن تعديل هذا الإجراء عن طريق استبداله بمسببات الأمراض الأخرى ، مثل بكتريا البرازي ل P.Aeruginosa ، مما يسهل البحث عن علاجات للعدوى البكتيرية الأخرى. لا تنس أن العمل مع البكتيريا المعدية مثل P.Aeruginosa أو E.Faecalis يمكن أن يكون خطيرا.

يجب دائما اتخاذ الاحتياطات المناسبة ، مثل التدريب المناسب ، ومعدات الحماية الشخصية الجيدة ، والتقنية المناسبة ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.