الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية
ديسمبر 26, 2016
يعد تحديد أهداف الأدوية الجديدة التي تنتقل من الاختبارات قبل السريرية إلى التجارب البشرية أولوية علمية. تحقيقا لهذه الغاية ، نصف هنا نهج الجينوم الوظيفي لفحص تأثير استنفاد الجينات على كرويات خط الخلايا السرطانية ، والتي تصمم بشكل أكثر ملاءمة السرطانات البشرية في الجسم الحي.
الهدف من بروتوكول شاشة siRNA هذا هو التحقيق في تأثير إسكات الجينات على نمو كروي خط الخلايا السرطانية. بالمقارنة مع تقنيات زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد ، تظهر الكرات الكروية السرطانية ظروفا أكثر تشابها مع تلك التي تواجهها الأورام في الجسم الحي. هذه الطريقة مفيدة للتقييم الوظيفي للجينات التي يتم تغييرها بشكل متكرر في السرطانات البشرية ، والأهم من ذلك ، يمكن استخدامها لتحديد الجينات المسرطنة المحتملة أو مثبطات الورم في ظل ظروف ثقافة أكثر تعقيدا ، مثل تلك التي تظهر في الثقافة ثلاثية الأبعاد ، وعلى وجه الخصوص ، تحت نقص الأكسجة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكيف بسهولة بحيث يمكن للباحثين استخدامها لدراسة جيناتهم الخاصة التي تهمهم في خطوط الخلايا المفضلة لديهم. نعتقد أنه يعتمد على مناهج فحص الحمض النووي الريبي المستهدفة الحالية. من المسلم به عموما أن الشاشات المستهدفة ، بدلا من سلالات الجينوم الكاملة ، تسمح للعلماء بطرح أسئلة محددة وتحقيق نتائج أكثر قوة.
لقد قمنا بتحليل تأثير إسكات الجينات على قابلية البقاء الكروية وحجمها ، ولكن يمكنك أيضا استخدام الأصباغ البيومترية لقراءة شاشة مختلفة ، مثل موت الخلايا المبرمج. إثبات الإجراء هو باتي واي من مختبرنا. ابدأ بإذابة الجليد من 96 لوحة تحتوي على مكتبة siRNA في درجة حرارة الغرفة.
ثم تدور لمدة خمس دقائق عند 1,000 مرة ، باستخدام جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 10 ميكرولترات من وسط المصل المخفض الذي يحتوي على كاشف التعداء المحسن إلى آبار كل لوحة. احتضن لمدة 15 دقيقة للسماح بتكوين مجمعات التعداء التي تحتوي على siRNA.
كما هو الحال مع أي خط أنابيب للفحص ، يجب تحسين قدرة التشكيل الكروي لخطوط الخلايا في ظروف التعدي بقوة قبل إجراء ملء الشاشة. بعد ذلك ، قم بتربسين الخلايا المراد فحصها حتى تنفصل عن القارورة. بمجرد انفصال الخلايا ، قم بتحييد التربسين بحجم مناسب من الوسط الخاص بخط الخلية ، ونقله إلى أنبوب طرد مركزي ، وقم بالدوران لمدة خمس دقائق عند 1 ، 000 مرة جم في جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة لجمع الخلايا.
تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات إلى معلق أحادي الخلية بحجم مناسب من المتوسط. قم بإجراء عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا التلقائي. ثم قم بتخفيف التعليق إلى 5 ، 000 خلية لكل 180 ميكرولتر بوسائط باردة.
انقل تعليق الخلية إلى خزان. باستخدام ماصة متعددة القنوات، مثبتة على 180 ميكرولترا، قم بخلط معلق الخلية ونقله إلى لوحة 96 بئرا تحتوي على siRNA. قم بالطرد المركزي للوحة عند 1 ، 000 مرة جم في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية.
في هذه المرحلة ، ستظهر الخلايا كفسيفساء في قاع الآبار. بعد 24 ساعة ، راقب الخلايا تحت المجهر. في هذه المرحلة ، يجب تجميع الخلايا معا لتشكيل كروي واحد في وسط البئر.
أضف 100 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى كل بئر لتشجيع النمو قبل العودة إلى الحاضنة. بعد ثلاثة أيام من النمو ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط برفق من كل بئر ، وأضف 100 ميكرولتر من الوسط الطازج. في اليوم السابع ، افحص الكرات تحت المجهر ، ثم تابع تحديد الحجم الكروي على قارئ اللوحة الذي يمكنه مراقبة نمو الكروية كميا بمرور الوقت.
لتحديد الحجم الكروي ، افتح البرنامج أولا على الكمبيوتر. حدد لوحة 96 بئرا ، وحدد نوع اللوحة المناسب ، وأدخل اسم التجربة. بعد ذلك ، أدخل الصفيحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على الكرويات في مقياس خلوي لتصوير لوحة البئر الدقيقة.
بعد ذلك ، حدد تطبيق Tumorsphere. حدد التركيز البؤري المستند إلى الصورة لتغيير التركيز بحيث يكون الكروي في نطاق التركيز وله التباين الأمثل. حدد الآبار التي تتطلب المسح وابدأ المسح.
بعد ذلك ، تأكد من أن قناع الكائن يمثل بدقة الحجم الكروي. بالنسبة لكرويات BT474 المزروعة لمدة سبعة أيام ، اضبط الدقة على عالية ، واضبط الحد الأدنى لقطر المستعمرة على 200 ميكرون. استخدم وظيفة التصدير لتصدير البيانات في شكل ملف بيانات مشروحة سيتم تحليله لتحديد siRNAs ذات التأثير ذي الدلالة الإحصائية على المنطقة الكروية.
بعد التصوير ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر ، وأضف 100 ميكرولتر من صبغة قابلية الإنارة لتحديد صلاحية الخلية. بعد احتضان الألواح لمدة 15 دقيقة ، قم بمسح اللوحة باستخدام قارئ لوحة مضيء. يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع خطوط الخلايا السرطانية الأخرى.
لم يؤثر إجراء التعدي العكسي للضوابط غير المستهدفة بشكل كبير على الجدوى لأي من الخطوط التي تم اختبارها ، في حين أن تعدي Ubiquitin B ، وهو تحكم إيجابي في قتل الخلايا ، قلل بشكل كبير من الجدوى. تم نقل خلايا BT474 بشكل عكسي باستخدام مكتبة siGENOME siRNA البشرية المكونة من 200 جين في ثلاث نسخ. لوحظت منطقة كروية وقابلية للحياة.
تم تحديد القيم المتطرفة المهمة ذات الدرجة z التي تزيد عن 1.7. يتم تظليل SiRNAs التي زادت أو قللت بشكل كبير من المساحة الكروية وقابليتها للبقاء باللون الأزرق ، واللون الأحمر يصور siRNAs التحكم. تظهر هذه المجموعة من الصور المجهرية صورا تمثيلية لكرويات BT474 بعد سبعة أيام من التعداء العكسي باستخدام E-Cadherin ، وهو عنصر تحكم غير مستهدف ، PIK3CA ، ERBB2 ، أو SF3B1 siRNA.
يوضح هذا الرسم البياني كيف أثر العلاج بكل siRNA على بقاء الخلية بعد سبعة أيام من التعدي العكسي. أدت ضربة قاضية ل ERBB2 و PIK3CA إلى تقليل قابلية الخلية للحياة بشكل كبير مقارنة بالضوابط. توضح هذه الصورة أنه يمكن تلطيخ الكرويات بنجاح للكشف عن تأثير إسكات الجينات على البروتينات المستهدفة.
بمجرد إتقانها ، يمكن فحص عدة مئات من الجينات في خطوط خلايا متعددة في يوم واحد ، وهذا يسمح بتحديد قوي للجينات الجديدة المحتملة المهمة للبقاء على قيد الحياة في الثقافة ثلاثية الأبعاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة الخلايا الكروية بنجاح والتي تكون قابلة لإسكات الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي. ستتمكن أيضا من التحقيق في تأثير إسكات الجينات عن طريق إجراء الكيمياء المناعية على الكرويات.
يمكن أن يوفر هذا معلومات مكانية قيمة قد تخبرك بالبيولوجيا الأساسية.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة نهجًا لعلم الجينوم الوظيفي لتحديد أهداف الدواء المحتملة من خلال فحص تأثيرات استنزاف الجينات على كرويات خطوط الخلايا السرطانية. توفر هذه الكرويات نموذجًا أكثر دقة للأورام البشرية في الجسم الحي مقارنة بالثقافات ثنائية الأبعاد التقليدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الجينوم الوظيفي
- بيولوجيا السرطان
- تقنيات زراعة الخلايا
الخلفية
- يمكن أن يكشف إسكات الجينات عن الجينات المسرطنة ومثبطات الأورام.
- تحاكي كرويات السرطان بيئة الورم بشكل أوثق من الثقافات ثنائية الأبعاد.
- يسمح فحص siRNA المستهدف بتحقيق تحقيق محدد في الجينات.
- يمكن دراسة الظروف المنخفضة الأكسجين باستخدام هذه الطريقة.
هدف الدراسة
- للتحقيق في تأثير إسكات الجينات على نمو كرويات السرطان.
- لتحديد الجينات التي قد تكون أهدافًا جديدة للعقاقير.
- لتعزيز فهم وظيفة الجين في بيئة زراعة ثلاثية الأبعاد.
الطرق المستخدمة
- فحص siRNA في كرويات خطوط الخلايا السرطانية.
- تحسين ظروف التهجين لتشكيل متين للكرويات.
- تحديد حجم الكروية وبقائها باستخدام قياس التصوير الخلوي.
- تحليل تأثيرات إسكات الجينات على بقاء الخلية ونموها.
النتائج الرئيسية
- تم ملاحظة تأثيرات كبيرة لـ siRNAs محددة على بقائية الكروية وحجمها.
- أدى إسكات ERBB2 و PIK3CA إلى انخفاض بقاء الخلية مقارنة بالضوابط.
- تم تحقيق تحديد قوي للجينات المهمة للبقاء في زراعة ثلاثية الأبعاد.
- تم إثبات قابلية تكيييف الطريقة لمختلف خطوط الخلايا السرطانية.
الاستنتاجات
- يسمح هذا النهج بفحص مئات الجينات في يوم واحد.
- يوفر أداة قيمة لتحديد أهداف علاجية محتملة في السرطان.
- تعزز الطريقة فهم وظيفة الجين في سياق أكثر ارتباطًا بفسيولوجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Functional genomics screening in 3D cancer spheroid models enhances target validation by revealing gene dependencies under physiologically relevant conditions. This approach improves predictive confidence in identifying novel drug targets by capturing tumor microenvironment influences often missed in 2D cultures. The method supports early discovery decisions by linking gene silencing effects to spheroid growth and viability, enabling mechanistic de-risking of candidate targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing the impact of gene silencing on cancer spheroid growth and viability.
- Operational Value: Enables functional assessment of frequently altered genes in human cancers under complex culture conditions.
- Predictive Value: Identifies potential oncogenes or tumor suppressors that are critical for survival in 3D culture, supporting target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Utilizes siRNA screening to generate quantitative readouts of spheroid area and viability for gene effect analysis.
- Operational Value: Requires optimization of transfection conditions and spheroid formation capacity to ensure robust and reproducible screening outcomes.
- Assay Readiness: Employs imaging cytometry and luminescent viability dyes to enable high-content, quantitative monitoring of spheroid growth over time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Confirms spatial impact of gene dependencies via immunohistochemistry, linking molecular findings to protein-level changes in spheroids.
- Preclinical Continuity: Demonstrates dependency on HER2 amplification and PIK3CA mutation in BT474 spheroids, validating known cancer drivers in a 3D model.
- Mechanistic De-risking: Provides spatial and functional validation of gene effects, reducing ambiguity in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for targets requiring validation in complex, hypoxia-prone tumor models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene knockdown to spheroid viability and size changes.
- Screening: Enables assay standardization through reverse transfection protocols and standardized spheroid formation in 96-well formats.
- Analytics: Generates quantitative spheroid area and viability data via imaging cytometry and luminescent readouts, enabling statistical identification of significant hits (e.g., z-score >1.7).
- Translational Research: Connects gene silencing effects to spatial protein expression via immunohistochemistry, enhancing biomarker alignment and mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Adaptable across cancer cell lines and siRNA libraries, positioning it as a reusable platform for target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing gene dependencies in a tumor-relevant 3D context.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized spheroid formation, transfection optimization, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from 2D models and increasing confidence in target essentiality.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence from physiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection techniques, and 3D model handling to ensure robust spheroid formation.
- Dependent on access to imaging cytometry and luminescent plate readers for quantitative spheroid size and viability assessment.
- Necessitates optimization of transfection conditions and cell density (5,000 cells/180 µL) for consistent spheroid formation across wells.
- Requires adaptation considerations when extending to other cancer cell lines or hypoxia-modulated conditions.
- Practical limitation: Screening throughput depends on siRNA library size and imaging capacity, though hundreds of genes can be screened per day once optimized.
