الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

الهدف من بروتوكول شاشة siRNA هذا هو التحقيق في تأثير إسكات الجينات على نمو كروي خط الخلايا السرطانية. بالمقارنة مع تقنيات زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد ، تظهر الكرات الكروية السرطانية ظروفا أكثر تشابها مع تلك التي تواجهها الأورام في الجسم الحي. هذه الطريقة مفيدة للتقييم الوظيفي للجينات التي يتم تغييرها بشكل متكرر في السرطانات البشرية ، والأهم من ذلك ، يمكن استخدامها لتحديد الجينات المسرطنة المحتملة أو مثبطات الورم في ظل ظروف ثقافة أكثر تعقيدا ، مثل تلك التي تظهر في الثقافة ثلاثية الأبعاد ، وعلى وجه الخصوص ، تحت نقص الأكسجة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكيف بسهولة بحيث يمكن للباحثين استخدامها لدراسة جيناتهم الخاصة التي تهمهم في خطوط الخلايا المفضلة لديهم. نعتقد أنه يعتمد على مناهج فحص الحمض النووي الريبي المستهدفة الحالية. من المسلم به عموما أن الشاشات المستهدفة ، بدلا من سلالات الجينوم الكاملة ، تسمح للعلماء بطرح أسئلة محددة وتحقيق نتائج أكثر قوة.

لقد قمنا بتحليل تأثير إسكات الجينات على قابلية البقاء الكروية وحجمها ، ولكن يمكنك أيضا استخدام الأصباغ البيومترية لقراءة شاشة مختلفة ، مثل موت الخلايا المبرمج. إثبات الإجراء هو باتي واي من مختبرنا. ابدأ بإذابة الجليد من 96 لوحة تحتوي على مكتبة siRNA في درجة حرارة الغرفة.

ثم تدور لمدة خمس دقائق عند 1,000 مرة ، باستخدام جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 10 ميكرولترات من وسط المصل المخفض الذي يحتوي على كاشف التعداء المحسن إلى آبار كل لوحة. احتضن لمدة 15 دقيقة للسماح بتكوين مجمعات التعداء التي تحتوي على siRNA.

كما هو الحال مع أي خط أنابيب للفحص ، يجب تحسين قدرة التشكيل الكروي لخطوط الخلايا في ظروف التعدي بقوة قبل إجراء ملء الشاشة. بعد ذلك ، قم بتربسين الخلايا المراد فحصها حتى تنفصل عن القارورة. بمجرد انفصال الخلايا ، قم بتحييد التربسين بحجم مناسب من الوسط الخاص بخط الخلية ، ونقله إلى أنبوب طرد مركزي ، وقم بالدوران لمدة خمس دقائق عند 1 ، 000 مرة جم في جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة لجمع الخلايا.

تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات إلى معلق أحادي الخلية بحجم مناسب من المتوسط. قم بإجراء عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا التلقائي. ثم قم بتخفيف التعليق إلى 5 ، 000 خلية لكل 180 ميكرولتر بوسائط باردة.

انقل تعليق الخلية إلى خزان. باستخدام ماصة متعددة القنوات، مثبتة على 180 ميكرولترا، قم بخلط معلق الخلية ونقله إلى لوحة 96 بئرا تحتوي على siRNA. قم بالطرد المركزي للوحة عند 1 ، 000 مرة جم في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية.

في هذه المرحلة ، ستظهر الخلايا كفسيفساء في قاع الآبار. بعد 24 ساعة ، راقب الخلايا تحت المجهر. في هذه المرحلة ، يجب تجميع الخلايا معا لتشكيل كروي واحد في وسط البئر.

أضف 100 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى كل بئر لتشجيع النمو قبل العودة إلى الحاضنة. بعد ثلاثة أيام من النمو ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط برفق من كل بئر ، وأضف 100 ميكرولتر من الوسط الطازج. في اليوم السابع ، افحص الكرات تحت المجهر ، ثم تابع تحديد الحجم الكروي على قارئ اللوحة الذي يمكنه مراقبة نمو الكروية كميا بمرور الوقت.

لتحديد الحجم الكروي ، افتح البرنامج أولا على الكمبيوتر. حدد لوحة 96 بئرا ، وحدد نوع اللوحة المناسب ، وأدخل اسم التجربة. بعد ذلك ، أدخل الصفيحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على الكرويات في مقياس خلوي لتصوير لوحة البئر الدقيقة.

بعد ذلك ، حدد تطبيق Tumorsphere. حدد التركيز البؤري المستند إلى الصورة لتغيير التركيز بحيث يكون الكروي في نطاق التركيز وله التباين الأمثل. حدد الآبار التي تتطلب المسح وابدأ المسح.

بعد ذلك ، تأكد من أن قناع الكائن يمثل بدقة الحجم الكروي. بالنسبة لكرويات BT474 المزروعة لمدة سبعة أيام ، اضبط الدقة على عالية ، واضبط الحد الأدنى لقطر المستعمرة على 200 ميكرون. استخدم وظيفة التصدير لتصدير البيانات في شكل ملف بيانات مشروحة سيتم تحليله لتحديد siRNAs ذات التأثير ذي الدلالة الإحصائية على المنطقة الكروية.

بعد التصوير ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر ، وأضف 100 ميكرولتر من صبغة قابلية الإنارة لتحديد صلاحية الخلية. بعد احتضان الألواح لمدة 15 دقيقة ، قم بمسح اللوحة باستخدام قارئ لوحة مضيء. يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع خطوط الخلايا السرطانية الأخرى.

لم يؤثر إجراء التعدي العكسي للضوابط غير المستهدفة بشكل كبير على الجدوى لأي من الخطوط التي تم اختبارها ، في حين أن تعدي Ubiquitin B ، وهو تحكم إيجابي في قتل الخلايا ، قلل بشكل كبير من الجدوى. تم نقل خلايا BT474 بشكل عكسي باستخدام مكتبة siGENOME siRNA البشرية المكونة من 200 جين في ثلاث نسخ. لوحظت منطقة كروية وقابلية للحياة.

تم تحديد القيم المتطرفة المهمة ذات الدرجة z التي تزيد عن 1.7. يتم تظليل SiRNAs التي زادت أو قللت بشكل كبير من المساحة الكروية وقابليتها للبقاء باللون الأزرق ، واللون الأحمر يصور siRNAs التحكم. تظهر هذه المجموعة من الصور المجهرية صورا تمثيلية لكرويات BT474 بعد سبعة أيام من التعداء العكسي باستخدام E-Cadherin ، وهو عنصر تحكم غير مستهدف ، PIK3CA ، ERBB2 ، أو SF3B1 siRNA.

يوضح هذا الرسم البياني كيف أثر العلاج بكل siRNA على بقاء الخلية بعد سبعة أيام من التعدي العكسي. أدت ضربة قاضية ل ERBB2 و PIK3CA إلى تقليل قابلية الخلية للحياة بشكل كبير مقارنة بالضوابط. توضح هذه الصورة أنه يمكن تلطيخ الكرويات بنجاح للكشف عن تأثير إسكات الجينات على البروتينات المستهدفة.

بمجرد إتقانها ، يمكن فحص عدة مئات من الجينات في خطوط خلايا متعددة في يوم واحد ، وهذا يسمح بتحديد قوي للجينات الجديدة المحتملة المهمة للبقاء على قيد الحياة في الثقافة ثلاثية الأبعاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة الخلايا الكروية بنجاح والتي تكون قابلة لإسكات الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي. ستتمكن أيضا من التحقيق في تأثير إسكات الجينات عن طريق إجراء الكيمياء المناعية على الكرويات.

يمكن أن يوفر هذا معلومات مكانية قيمة قد تخبرك بالبيولوجيا الأساسية.