Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد ناقل يتمتع باستقرار كافٍ للدراسات التركيبية، واستخدام هذا الناقل المعدل لإنتاج بلورات تعطي حيوداً بدقة عالية عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا التركيبية، مثل كيفية حل بنية بروتينات الغشاء التي تُعد أهدافاً دوائية مهمة. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدامها لاختيار هيئة مرتبطة بدواء باستخدام مقايسة وظيفية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول ناقلات النواقل العصبية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على المستقبلات والقنوات والبروتينات الذائبة التي ترتبط بالجزيئات الصغيرة ذات الألفة العالية. أعد تعليق خلايا HEK293S GnTI minus المعالجة بالتربسين تماماً في وسط DMEM المدعم بـ 10% fetal bovine serum لتصل كثافتها إلى 0.5 million cells per milliliter في خزان ماصات يستخدم لمرة واحدة. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 µL من الخلايا إلى كل بئر في طبق مطلي بـ poly-D-lysine.

أعد تعليق الخلايا في خزان الماصة بعد ملء كل طبق لضمان توزيع الخلايا بشكل متساوٍ. قم بتحضين الخلايا في حاضنة عند 37 °C مع 8% carbon dioxide. استبدل الوسط الزرعي للخلايا قبل ساعة واحدة من عملية النقل الجيني (transvection).

قم بتحضير معقدات كاشف نقل الحمض النووي (DNA transvection reagent complexes) عن طريق خلط 450 nanograms من DNA مع 45 microliters من وسط DMEM الخالي من المصل لكل بناء في خلفية cert TC المراد فحصها. بعد ذلك، أضف 1.6 microliters من كاشف النقل إلى 45 microliters من وسط DMEM الخالي من المصل وامزجهما. أضف فوراً محلول كاشف النقل المخفف إلى محلول DNA وامزجهما.

لا تخلط المحاليل بترتيب عكسي. انتظر من 10 إلى 15 دقيقة قبل إضافة 20 µL من خليط DNA الخاص بكاشف النقل إلى أربعة من الآبار. قم بحضن الخلايا مع 200 nM من citalopram و 25 µL من TBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لإذابة الخلايا، أضف 25 µL من C12M بتركيز 8 mM، وCHS بتركيز 1 mM، ومزيج مثبطات البروتياز في محلول TBS. قم بتحضين الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول TBS الذي يحتوي على 20 nM من citalopram المسمى بالتريتيوم، و0.1% من bovine serum albumin، وmg/mL من حبيبات مقايسة القرب الومضية بكروماتوغرافيا الألفة لوسم الهيستيدين (his tag affinity scintillation proximity assay or SPA Beads)، إلى ثلاثة آبار لكل بنية جزيئية.

أضف إلى البئر الأخير محلول TBS نفسه، ولكن مع تدعيمه بـ 100 micromolar من السيرترالين (sertraline) لتحديد الارتباط غير النوعي. تأكد من خلط حبيبات SPA ذات الألفة لوسم الهيستيدين (his tag) جيداً عند إضافتها إلى لوحة الـ 96 بئراً. قم بقياس ارتباط السيتالوبرام (citalopram) الموشح بالتريتيوم باستخدام عداد وميضي لـ 96 بئراً في درجة حرارة الغرفة، مع زمن عد مدته دقيقة واحدة لكل بئر.

استمر في عد الأطباق حتى تستقر إجماليات العد عند حوالي 36 ساعة. بعد القياس، قم بتسخين الأطباق لمدة 15 دقيقة في كتلة تسخين ذات غطاء مسخن عند 33 درجة Celsius. قم بقياس ارتباط citalopram المسمى بالتريتيوم مرة أخرى بعد التسخين.

كرر هذه الخطوات مع تعديل خطوة التسخين. اضبط درجات حرارة التسخين بناءً على درجة حرارة الانصهار الظاهرية للبروتين المستهدف والاستقرار الحراري للبنية الأكثر استقراراً. استمر في تسخين الأطباق حتى تسجل جميع البنى تعدادات نوعية منخفضة.

قم بتنمية خلايا HEK293S GnTI minus في حالة تعليق عند درجة حرارة 37 °C مع 8% ثاني أكسيد الكربون و85% رطوبة على هزاز بسرعة 130 RPM وباستخدام وسط تعبير 293 مضاف إليه 2% مصل بقري جنيني. قم بإصابة 10 لترات من الخلايا بفيروس P2 بمعدل إصابة (MOI) قدره 2 وكثافة تبلغ ثلاثة ملايين خلية لكل milliliter. بعد 12 إلى 16 ساعة من الإصابة، أضف بوتيرات الصوديوم لتصل إلى تركيز 10 millimolar من محلول مخزون بتركيز 1 molar.

بعد 48 إلى 60 ساعة من الإصابة، يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4,000 ×g لمدة 15 دقيقة. يتم التخلص من السائل الطافي، ثم تُعاد تعليق الخلايا في 150 milliliters من محلول TBS مع 2 micromolar من escitalopram أو مثبطات SERT الأخرى.

تُجمع الخلايا من 10 لترات من المزرعة في ماء دافئ عند درجة حرارة 30 درجة Celsius تقريباً، ثم تُعلق مجدداً عن طريق تمرير الخلايا بسرعة عبر ماصة سعة 10 ملليلتر حتى يصبح الخليط متجانساً. تُضاف جميع الخلايا إلى دورق يحتوي على قضيب تحريك، ثم يُضاف كامل محلول المنظف إلى الخلايا مع التحريك المستمر. تُترك الخلايا لتذوب عند درجة حرارة 4 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة مع التحريك.

قم بطرد محلول التحلل مركزياً عند 8,000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. صب السائل الطافي في أنابيب طرد مركزي فائقة نظيفة وتخلص من الراسب. بعد ذلك، قم بطرد السائل الطافي مركزياً عند 100,000 ×g لمدة ساعة واحدة في جهاز طرد مركزي فائق.

بعد عملية الطرد المركزي الفائق، قم بترشيح السائل الطافي عبر مرشح بمسامية 0.2 micron وتخلص من الراسب. بعد ذلك، مرر المستخلص عبر 10 milliliters من راتنج تقارب الـ strep المحشو في عمود باستخدام مضخة تمعجية تمت موازنتها بمحلول الغسل المنظم. ثم قم بتوصيل عمود تقارب الـ strep بنظام الكروماتوغرافيا السائلة السريعة للبروتينات واغسل العمود بمعدل تدفق ملليليترين في الدقيقة باستخدام 66 milliliters من محلول الغسل المنظم.

قم باستخلاص البروتين المنقى باستخدام منظم الغسيل نفسه مضافاً إليه 5 millimolar من الديسثيوبايوتين (desthiobiotin) بمعدل 0.5 milliliters في الدقيقة وباستخدام 33 milliliters من المنظم. اجمع كسوراً بحجم 1 milliliter لكل كسر. ستكون كسور الذروة حوالي 10 milliliters.

لتكوين معقدات الناقل مع الأجسام المضادة، قم أولاً بهضم البروتين المنقى طوال الليل في درجة حرارة الغرفة باستخدام thrombin لإزالة العلامات (tags) وEndo H لإزالة السلاسل السكرية. ركز البروتين ليصل إلى تركيز 10 mg/mL وحجم يتراوح بين 250 إلى 300 µL باستخدام جهاز تركيز البروتين بالطرد المركزي بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 100 kDa. اخلط بروتين SERT المركز مع 8B6 Fab بنسبة مولية تبلغ 1 إلى 1.2 في حجم أقل من 500 µL.

قم بطرد الخليط مركزياً عند 100,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. بعد عملية الطرد المركزي، اجمع السائل الطافي الذي يحتوي على معقد SERT Fab، وتخلص من الراسب. قم بفصل المعقد باستخدام تقنية الكروماتوغرافيا السائلة السريعة للبروتين على عمود استبعاد الحجم.

قم بموازنته باستخدام محلول TBS المضاف إليه المكملات بمعدل 0.5 milliliters في الدقيقة. قبل عملية البلورة، قم بتركيز أجزاء الذروة الناتجة من فصل المعقد لتصل إلى تركيز two milligrams لكل milliliter باستخدام جهاز تركيز البروتين بالطرد المركزي ذو حد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 100 kilodalton. إن امتصاصية قدرها two AU عند 280 nanometers تعادل one milligram لكل milliliter.

أضف كمية إضافية من Fab بنسبة 1 إلى 0.05 من المعقد إلى Fab الحر. أضف أيضاً 10 micromolar من s-citalopram الحر. بعد طرد العينة مركزياً، اجمع الطافي الذي يحتوي على معقد SERT Fab وتخلص من الراسب.

قم بإعداد فحص مسحي بطريقة القطرة المعلقة في طبق يحتوي على 24 بئراً عند درجة حرارة 4 °C وفقاً للجدول 1 في البروتوكول النصي. قم بنقل 500 µL من كل محلول خزان باستخدام الماصة إلى طبق 24 بئراً منخفض المرتفع مع وضع مادة مانعة للتسرب في كل بئر. قم بنقل 1.5 و 1.75 و 2 µL من معقد SERT Fab باستخدام الماصة على شريحة غطاء زجاجية مسيليكونة بقطر 18 mm.

ثم قم بنقل 1 µL من محلول الخزان باستخدام الماصة فوق عينة البروتين. ستظهر بلورات مفردة في غضون ثلاثة أيام تقريباً وتنمو لتصل إلى 100 إلى 175 µm بعد 14 يوماً. تظهر هنا نتائج تمثيلية لفحص الاستقرار الحراري في وجود citalopram المسمى بالتريتيوم.

توضح قيم درجة حرارة الانصهار المرسومة مقابل الحد الأقصى للارتباط الطفرات ذات الاستقرار الحراري والتعبير العاليين. ومعروضة هنا منحنيات الاستقرار الحراري لـ SERT TC من النوع البري وأفضل ثلاث طفرات، وهي Y110A وI291A وT439S. وتظهر صورة المجهر هذه خلايا HEK293S GnTI minus التي تعبر عن SERT CC مع وجود فلورة خضراء على غشاء الخلية.

يُظهر تحليل الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم مع الكشف الفلوري لـ SERT CC ذروة رئيسية عند 15 milliliters. كما يوضح التحليل باستخدام SDS-PAGE وجود نوع بروتيني واحد خالٍ إلى حد كبير من الملوثات. يظهر في الشكل الفصل النموذجي لمعقدات الناقل والأجسام المضادة بواسطة الكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم.

احتوت القمة الرئيسية التي شطبت عند 11.5 milliliters على كل من SERT و Fab كما ظهر في هلام SDS-PAGE. ويظهر الفحص بالمجهر الضوئي لمعقد أجسام SERT المضادة المرتبط بـ S citalopram بعد أسبوعين من النمو بلورات منشورية الشكل يتراوح حجمها تقريباً بين 100 إلى 175 microns. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الطفرات التي تثبت بروتيناً غشائياً في هيئة مرتبطة بربيطة، وكيفية إعداد مسوحات التبلور باستخدام معقدات البروتين والأجسام المضادة.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الربيطات ضرورية لاستقرار SERT TC وأساسية لبلورة SERT CC. تمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج الحالات النفسية لأن SERT يمثل الهدف الجزيئي للعديد من الأدوية المضادة للاكتئاب. عقب هذا الإجراء، يمكن توصيف وظيفة SERT المنقى باستخدام طرق كيميائية حيوية وفيزيائية حيوية.