Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل S -citalopram

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد ناقل مستقر بدرجة كافية للدراسات الهيكلية ، واستخدام هذا الناقل المعدل لإنتاج بلورات تنكسر إلى دقة عالية بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الهيكلية ، مثل كيفية حل بنية بروتينات الغشاء التي تعد أهدافا دوائية مهمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها للاختيار من بين التشكل المرتبط بالدواء باستخدام اختبار وظيفي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لناقلات الناقل العصبي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على المستقبلات والقنوات والبروتينات القابلة للذوبان ، والتي تربط الجزيئات الصغيرة ذات التقارب العالي. أعد تعليق خلايا التربسون HEK293S GnTI ناقص تماما في DMEM المكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ بكثافة 0.5 مليون خلية لكل مليلتر في خزان ماصة يمكن التخلص منه. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من الصفيحة المطلية ب poly-D-lysine.

أعد تعليق الخلايا في خزان الماصة بعد ملء كل لوحة لضمان التوزيع المتساوي للخلايا. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 8٪ ثاني أكسيد الكربون. استبدل الوسائط الخلوية قبل ساعة واحدة من النقل.

قم بإعداد مجمعات كاشف نقل الحمض النووي عن طريق خلط 450 نانوغراما من الحمض النووي مع 45 ميكرولترا من DMEM الخالي من المصل لكل بنية في خلفية TC للشهادة ليتم فحصها. ثم أضف 1.6 ميكرولتر من كاشف النقل إلى 45 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل واخلطه. أضف على الفور محلول كاشف الحمل المخفف إلى محلول الحمض النووي واخلطه.

لا تخلط المحاليل بترتيب عكسي. انتظر من 10 إلى 15 دقيقة قبل إضافة 20 ميكرولترا من خليط الحمض النووي لكاشف الحمل إلى أربعة من الآبار. احتضان الخلايا ب 200 نانومولار سيتالوبرام و 25 ميكرولتر من TBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لإذابة الخلايا ، أضف 25 ميكرولترا من ثمانية مللي مولار C12M ، وواحد مليمولار CHS ، وكوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني في TBS. احتضن الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 50 ميكرولترا من TBS مع 20 نانومولار من السيتالوبرام الترتيتيد ، و 0.1٪ ألبومين مصل البقر ومليغرام لكل مليلتر من مقايسة القرب من تقارب التقارب أو حبات SPA ، إلى ثلاثة آبار لكل بناء.

بالنسبة للبئر الأخير ، أضف نفس محلول TBS ، ولكن استكمل مع 100 ميكرومولار سيرترالين لتحديد الارتباط غير المحدد. تأكد من خلط حبات SPA ذات تقارب العلامة الخاصة به تماما عند إضافتها إلى لوحة البئر 96. قم بقياس ربط سيتالوبرام الترتيتيد باستخدام عداد تلألؤ 96 بئر في درجة حرارة الغرفة مع وقت عد لمدة دقيقة واحدة لكل بئر.

استمر في عد اللوحات حتى يستقر إجمالي التهم في حوالي 36 ساعة. بعد القياس ، قم بتسخين الأطباق لمدة 15 دقيقة في كتلة تسخين بغطاء ساخن عند 33 درجة مئوية. قم بقياس ربط سيتالوبرام الترتيتيته مرة أخرى بعد التسخين.

كرر هذه الخطوات مع تعديل خطوة التسخين. اضبط درجات حرارة التسخين اعتمادا على درجة حرارة الانصهار الظاهرة للبروتين المستهدف والثبات الحراري للبنية الأكثر استقرارا. استمر في تسخين الألواح حتى يكون لجميع التركيبات عدد محدد منخفض.

تنمو HEK293S GnTI ناقص الخلايا في حالة تعليق عند 37 درجة مئوية مع 8٪ ثاني أكسيد الكربون و 85٪ رطوبة على شاكر عند 130 دورة في الدقيقة و 293 وسائط تعبير مكملة بمصل بقري جنيني 2٪. تصيب 10 لترات من الخلايا بفيروس P2 في تعدد العدوى اثنين وكثافة ثلاثة ملايين خلية لكل مليلتر. بعد 12 إلى 16 ساعة من الإصابة ، أضف زبدات الصوديوم إلى تركيز 10 ملليمولار من مخزون مولي واحد.

48 إلى 60 ساعة من الإصابة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 4 ، 000 مرة G لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 150 مل من TBS باستخدام 2 micromolar escitalopram أو مثبطات SERT الأخرى.

الخلايا من 10 لترات من الثقافة في الماء الدافئ حوالي 30 درجة مئوية وإعادة تعليقها عن طريق تمرير الخلايا بسرعة عبر ماصة 10 ملليلتر حتى تصبح متجانسة. أضف جميع الخلايا إلى دورق باستخدام شريط تقليب وأضف كل محلول المنظف إلى الخلايا أثناء التحريك. قم بإذابة الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة مع التحريك.

قم بتدوير المحللة عند 8 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. صب المادة الطافية في أنابيب طرد مركزي نظيفة للغاية وتخلص من الحبيبات. ثم قم بتدوير المادة الطافية عند 100 ، 000 مرة G لمدة ساعة واحدة في جهاز طرد مركزي فائق.

بعد الطرد المركزي الفائق ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.2 ميكرون وتخلص من الحبيبات. بعد ذلك ، مرر المحللة أكثر من 10 ملليلتر من عبوات راتنج تقارب البكتيريا العقدية في عمود باستخدام مضخة محيطية متوازنة في مخزن الغسيل. ثم قم بتوصيل عمود تقارب البكتيريا العقدية بنظام كروماتوغرافيا سائل سريع البروتين واغسل العمود بمعدل ملليلترين في الدقيقة باستخدام 66 مل من محلول الغسيل.

قم بتخفيض البروتين المنقى في نفس مخزن الغسيل المكمل بخمسة مللي مولار ديستيوبيوتين بمعدل 0.5 مل في الدقيقة باستخدام 33 مل من العازلة. اجمع كسور مليلتر واحدة. ستكون أجزاء الذروة حوالي 10 ملليلتر.

لتشكيل مجمعات الأجسام المضادة الناقلة ، قم أولا بهضم البروتين المنقى طوال الليل في درجة حرارة الغرفة باستخدام الثرومبين لإزالة العلامات و Endo H لإزالة الجليكوزيل. تركيز البروتين على تركيز 10 ملليغرام لكل مليلتر وحجم 250 إلى 300 ميكرولتر باستخدام مكثف بروتين الطرد المركزي بالوزن الجزيئي 100 كيلودالتون. امزج بروتين SERT المركز مع 8B6 Fab بنسبة مولية من واحد إلى 1.2 بحجم أقل من 500 ميكرولتر.

الطرد المركزي الخليط على حرارة 100 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على مركب SERT Fab ، وتخلص من الحبيبات. افصل المجمع باستخدام كروماتوغرافيا البروتين السائل السريع على عمود استبعاد الحجم.

قم بتوازنها مع TBS المكملة بمعدل 0.5 مل في الدقيقة. قبل التبلور ، قم بتركيز أجزاء الذروة من فصل المركب إلى ملليغرامين لكل مليلتر باستخدام مكثف بروتين الطرد المركزي بوزن جزيئي 100 كيلودالتون. امتصاص اثنين من AU عند 280 نانومتر يساوي ملليغرام واحد لكل مليلتر.

أضف فاب إضافيا بنسبة واحد إلى 0.05 مركب إلى فاب المجاني. أضف أيضا 10 ميكرومولار خالية من S citalopram. بعد الطرد المركزي للعينة ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على مركب SERT Fab وتخلص من الحبيبات.

قم بإعداد شاشة معلقة 24 بئر عند أربع درجات مئوية وفقا للجدول الأول في بروتوكول النص. ماصة 500 ميكرولتر من كل محلول خزان في صفيحة منخفضة الحجم 24 بئر مع مادة مانعة للتسرب توضع على كل بئر. الماصة 1.5 و 1.75 وميكرولترين من مجمع SERT Fab على زلة غطاء زجاجي من السيليكون مقاس 18 ملم.

ثم قم بعمل ميكرولتر واحد من محلول الخزان فوق عينة البروتين. ستظهر البلورات المفردة في غضون ثلاثة أيام تقريبا وتنمو إلى 100 إلى 175 ميكرومتر بعد 14 يوما. تظهر هنا نتائج تمثيلية لفحص الثبات الحراري في وجود سيتالوبرام متريتيت.

قيم درجة حرارة الانصهار المرسومة مقابل الحد الأقصى للربط طفرات ذات ثبات حراري وتعبير عاليين. معروضة هنا منحنيات الثبات الحراري ل SERT TC من النوع البري والطفرات الثلاثة الأولى ، Y110A و I291A و T439S. تظهر صورة الفحص المجهري هذه HEK293S GnTI ناقص خلايا تعبر عن SERT CC مع التألق الأخضر الموجود على غشاء الخلية.

يظهر كروماتوغرافيا استبعاد حجم الكشف عن التألق ل SERT CC ذروة رئيسية عند 15 ملليلترا. يعرض التحليل الذي أجرته SDS-PAGE نوعا واحدا من البروتين خال إلى حد كبير من الملوثات. يظهر الفصل التمثيلي لمجمعات الأجسام المضادة الناقلة حسب اللونياتوغرافيا لاستبعاد الحجم.

احتوت الذروة الرئيسية عند 11.5 مليلتر على كل من SERT و Fab كما هو موضح في جل SDS-PAGE. يظهر الفحص المجهري الضوئي لمركب الأجسام المضادة SERT المرتبط ب S citalopram بعد أسبوعين من النمو بلورات على شكل منشور تتراوح من 100 إلى 175 ميكرون تقريبا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الطفرات التي تعمل على تثبيت بروتين الغشاء في تأكيد مرتبط بالترابط وكيفية إعداد شاشات التبلور بمجمعات الأجسام المضادة للبروتين.

عند محاولة القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الروابط ضرورية لتثبيت SERT TC وهي ضرورية لبلورة SERT CC ، وتمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج الحالات النفسية لأن SERT هو الهدف الجزيئي للعديد من الأدوية المضادة للاكتئاب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تمييز وظيفة SERT المنقى باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية.