اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

الهدف العام من اختبار التزاوج هذا هو تقييم آثار الطفرات داخل جين النقل الاقترافي على قدرته على التأثير على نقل البلازميد في سياق مركب إفراز وظيفي من النوع الرابع. تسمح هذه الطريقة بطرح أسئلة خاصة بالبروتين ، مثل تحديد مناطق تفاعلات البروتين والبروتين التي تحدث بين بروتينات النقل أثناء قيامها بتجميع نظام إفراز وظيفي من النوع الرابع في الاقتران البكتيري. في هذه التقنية ، يتم التخلص من الجينات الموجودة على البلازميدات المترافقة الكبيرة عن طريق إعادة التركيب المتماثل.

يتم تقييم وظيفة الجين من خلال توفير الجين المستهدف للضربات القاضية على بلازميد أصغر. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التنظيم والإعداد هما المفتاح لإجراء هذا الإجراء بنجاح. التحضير التجريبي المناسب ضروري للحصول على نتائج قابلة للتفسير.

ابدأ هذا البروتوكول بإعداد بلازميد pBAD33 المهضوم كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتشغيل كل ملخص على هلام الاغاروز. باستخدام خزانة الأشعة فوق البنفسجية وشفرة الحلاقة المعقمة ، قم بقص الشريط الأساسي الذي يبلغ وزنه 2.8 كيلو والذي يتوافق مع تسلسل القسطرة من الجل.

اعمل بسرعة لتقليل تعرض الحمض النووي للأشعة فوق البنفسجية. استخرج الحمض النووي من شريحة الجل المقطوعة باستخدام مجموعة استخراج الجل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. لتضخيم كاسيت القط المستخرج عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

تحضير خليط التفاعل في أنبوب PCR معقم. استخدم البادئات التي تحتوي على نتوءات متماثلة مع تسلسل الجين المستهدف لإعادة التركيب المتماثل. قم بإعداد عنصر تحكم سلبي يحمل نفس المكونات ، باستثناء استبدال الحمض النووي للقالب بالماء المقطر المزدوج.

أيضا ، قم بإعداد عنصر تحكم إيجابي باستخدام قالب الحمض النووي والبادئات التي ثبت أنها تعمل في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). امزج جميع محتويات التفاعل برفق عن طريق سحب العينات. بعد ذلك ، قم بتضخيم كاسيت القط المستخرج باستخدام معلمات PCR المدرجة في بروتوكول النص.

استخدم خمسة ميكرولترات فقط من كل تفاعل لتأكيد الحجم الصحيح للتضخيم عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. قم بتنقية أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية PCR مع بروتوكول الشركة المصنعة. أضف 300 نانوجرام من كاسيت القط المضخم إلى 50 ميكرولترا من خلايا DY330R ذات الكفاءة الكهربائية ، مما يؤوي بلازميد pOX38-Tc على الجليد.

مرر الماصة برفق لأعلى ولأسفل للخلط. كرر هذه الخطوة باستخدام بلازميد pBAD33 غير المعدل كعنصر تحكم إيجابي. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى كوفيت كهربائي مبرد مسبقا بمقدار ملليمتر واحد.

قم بتكليف الخلايا بالكهرباء عند 1.8 كيلو فولت بثابت زمني يبلغ 5.5 مللي ثانية باستخدام المثقور الكهربائي. على الفور ، بعد تطبيق النبض ، قم بتخفيف الخلايا بملليلتر واحد من وسائط SOC ونقلها إلى أنبوب ميكروفيج جديد. احتضان الخلايا عند 32 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، قم بتناول 100 ميكرولتر من كل عينة إلى ألواح أجار تحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من التتراسيكلين و 20 ميكروغرام لكل مليلتر من الكلورامفينيكول. انشر الكمية على الطبق باستخدام موزعة معقمة. احتضن اللوحة رأسا على عقب عند 32 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، حدد المؤتلفات الناجحة. سيخضع كاسيت القط الذي يتم إدخاله في الخلية لإعادة تركيب متماثل مع الجين محل الاهتمام ويخلق استنساخ pOX38-Tc chloramphenicol بالضربة القاضية. افصل التثقيب الكهربائي 300 نانوجرام من جين pK184 أو البلازميد الجيني المتحور pK184 إلى 50 ميكرولترا من خلايا DY330R الكهربائية التي تؤوي البلازميد pOX38-Tc كلورامفينيكول بالضربة القاضية كما كان من قبل.

لتوليد الخلايا المانحة XK1200 ، قم بإجراء التزاوج المترافق متبوعا بالتثقيب الكهربائي لتوليد خلايا XK1200 التي تضغط على كل من خروج الكلورامفينيكول بالضربة القاضية وبلازميد PK184 كما هو موضح في بروتوكول النص. تحضير مزرعة ليلية لهذه الخلايا المانحة XK1200 في 20 مل من LB المعقم مع الكلورامفينيكول والكاناميسين. قم أيضا بإعداد الخلايا المتلقية ل MC4100 في 50 مل من LB مع 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين باستخدام خلايا من مخزون الجلسرين أو من مستعمرة واحدة على لوحة أجار.

قم بزراعة الثقافات عند 37 درجة مئوية ، واهتز عند 200 دورة في الدقيقة. أضف الجلوكوز إلى التركيز النهائي البالغ 100 مللي مولار لجميع الخلايا المانحة. في اليوم التالي ، قم بعمل 1 من كل 70 تخفيفا من كل مزرعة ليلية على حدة في ملليلترين من LB المعقم مع نفس المضادات الحيوية.

قم بتنمية الخلايا إلى منتصف مرحلة السجل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. الطرد المركزي لزراعة الخلايا لحبيبات الخلايا والتخلص من المادة الطافية. ثم, اغسل حبيبات الخلية مرة واحدة باستخدام LB المعقم البارد لإزالة المضادات الحيوية.

بعد الطرد المركزي مرة ثانية كما كان من قبل ، نقوم بتعليق الخلايا في ملليلترين من البارد المعقم LB.In تكرار ، ونضع 100 ميكرولتر من الخلايا المانحة و 100 ميكرولتر من الخلايا المتلقية إلى 800 ميكرولتر من وسائط LB المعقمة لحجم إجمالي مليلتر واحد. اسمح للخلايا بالتزاوج عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة دون اهتزاز. بعد ساعة ، قم بدوامة الخلايا لمدة 30 ثانية لتعطيل أزواج التزاوج.

ثم ضع الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق لمنع المزيد من التزاوج. باستخدام مزارع السجل المتوسطة و LB المعقم الطازج ، قم بإعداد ستة تخفيفات تسلسلية للخلايا المانحة والمتلقية من 1 و 100 إلى 1 و 10 ملايين. في كل من نصفين من صفيحة أجار تحتوي على حمض النالاديكسيك والكلورامفينيكول والكاناميسين ، ضع 10 ميكرولتر من كل تخفيف من الخلايا المانحة XK1200.

كرر اكتشاف تخفيفات خلايا MC4100 المتلقية على ألواح أجار التي تحتوي على الستربتومايسين. ثم احتضن الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، باستخدام خليط الدوامة و LB المعقم الطازج ، قم بإعداد ستة تخفيفات من القارفات.

حدد الخلايا MC4100 المرتفقة التي تؤوي pOX38-Tc كلورامفينيكول بالضربة القاضية بو ، حيث تكتشف عشرة ميكرولتر من كل تخفيف على كل نصف من ألواح أجار التي تحتوي على الستربتومايسين والكلورامفينيكول. كرر مع كلا الخلطين المكررين. ثم احتضن الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

احسب كفاءة التزاوج عن طريق حساب عدد المستعمرات من نفس اكتشاف التخفيف لكل خلايا مانحة ومتلقية وعبر الاقتران على لوحات خاصة بها. أيضا ، احسب المستعمرات المتلقية لاختبار أي تحيز ناتج عن عدد أكبر من القارنات مقارنة بالمستلمين في هذا التخفيف المحدد. احسب كفاءة التزاوج على أنها عدد المستعمرات المتشابكة مقسوما على عدد المستعمرات المانحة ، مضروبا في 100 للحصول على قيمة الكفاءة لكل 100 خلية مانحة.

عندما يتم إخراج نظام الإفراز من النوع الرابع gene-tra-F من بلازميد pOX38-Tc ، فإنه يؤدي إلى فقدان النقل المترافق ل pOX38-Tc traF chloramphenicol يضرب البلازميد من الخلايا المانحة إلى الخلايا المتلقية. ومع ذلك ، عندما يتم توفير جين traF عبر بواسطة بلازميد PK184 traF والخلايا المانحة ، لوحظ استعادة النقل المترافق لبلازميد pOX38-Tc traF chloramphenicol بالضربة القاضية. عند تزويدها بطفرات التخفيف من traF وبلازميد PK184 في الخلايا المانحة ، يمكن ملاحظة فقدان النقل المترافق لبلازميد pOX38-Tc traF chloramphenicol بالضربة القاضية.

فقدان النقل المترافق إلى منطقة البروتين المهمة لتفاعلات البروتين والبروتين داخل نظام الإفراز المترافق من النوع الرابع. يمكن بعد ذلك فحص هذه المنطقة بمزيد من التفصيل عن طريق الطفرات النقطية التي تؤثر على كفاءة النقل. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في يوم عمل واحد مع أوقات النمو المتوقعة.

يمكن إجراء هذا البروتوكول على خلايا أخرى غير تلك الموضحة هنا. الجانب الحاسم ، في هذه المرحلة ، هو أن الخلايا المانحة والمتلقية لا تؤوي البلازميد محل الاهتمام. بحيث لا تحصل على نتائج متضاربة عند إضافة البلازميد بالضربة القاضية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تكون منظما للغاية نظرا لوجود ظروف نمو ومضادات حيوية مختلفة للخلايا المانحة والمتلقية والمترافقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل علم البلورات أو الرنين المغناطيسي النووي أو قياس الطيف الكتلي من أجل الحصول على صورة هيكلية ووظيفية مفصلة للبروتين محل الاهتمام.