منهجية لدراسة نقل أفقي جين في المكورات العنقودية الذهبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير منهجية مفصلة لدراسة الانتقال الأفقي للحمض النووي في المكورات العنقودية الذهبية من خلال معالجة مسارات النقل الرئيسية الثلاثة. الاقتران والتنبيغ والتحول الطبيعي. تدور هذه الطريقة حول النقل الأفقي للجينات المقاومة للمضادات الحيوية في المكورات العنقودية الذهبية لمسببات الأمراض البشرية.

الميزة الرئيسية للتقنيات المقدمة هنا هي أنه يمكننا اختبار ثلاثة طرق رئيسية للنقل ، بما في ذلك التحول الجيني الطبيعي المكتشف مؤخرا ، وسيكون Le Thuy ، طالب دكتوراه من مختبرنا ، يوضح الإجراء Le Thuy ، وهو طالب دكتوراه من مختبرنا. لبدء التجربة ، قم بإعداد خمسة ملليلتر من المزرعة الليلية للمتبرع والبكتيريا المتلقية في مرق الصويا التريبتي. أو وسيط TSB مع وبدون 32 ملليغرام لكل لتر كلورامفينيكول ، على التوالي.

مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، اضبط الكثافة البصرية للثقافات الليلية على واحدة مع وسيط TSB جديد. امزج 0.5 مل من ثقافة المتبرعين مع 0.5 مل من الثقافة المتلقية.

وأضف ملليلترا واحدا من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS إلى الخليط. ثم باستخدام نظام مضخة تفريغ ، انقل خليط البكتيريا إلى غشاء مرشح 0.45 ميكرومتر. ضع أغشية المرشح على صفيحة أجار دم الأغنام.

احتضن الصفائح عند 37 درجة مئوية ليوم واحد. أخرج غشاء المرشح من اللوحة وعلقه في 10 ملليلتر من PBS. دوامة الخليط لمدة دقيقة تقريبا لجمع جميع البكتيريا المرتبطة بالغشاء.

قم بعمل تخفيف تسلسلي 10 أضعاف للتعليق البكتيري باستخدام TSB الجديد. لوحة 100 ميكرولتر من العينات المخففة 0 ، 10 ، 4 على أجار TSB. أو صفائح TSA المكملة ب 32 ملليغرام لكل لتر من الكلورامفينيكول وثمانية ملليغرامات لكل لتر من التتراسيكلين لاختيار المركبات المتغيرة.

لوحة 100 ميكرولتر من التعليق المخفف على ألواح TSA مع ثمانية ملليغرام لكل لتر التتراسيكلين وحده. لحساب العدد الإجمالي للمستلمين. بعد الحضانة ، قم بتحليل المستعمرات المزدوجة المقاومة لوجود جين CFR بواسطة مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل وملامح قابليتها للتأثر.

تحديد المضاد الحيوي عن طريق قياس الحد الأدنى من التركيزات المثبطة ، MICs ، للمضادات الحيوية المناسبة وفقا لطريقة التخفيف الدقيق القياسية أو طريقة نشر القرص. يجب أن يكون ملف تعريف الحساسية للمواد المتغيرة مطابقا للمتلقي. باستثناء الكلورامفينيكول والمركبات الأخرى المتأثرة بجين CFR.

لاستبعاد مقاومة التتراسيكلين التي طورتها سلالة المتبرع. قم بإعداد ثقافة بين عشية وضحاها من N315-45 في خمسة ملليلتر من مرق المغذيات مع 3.6 ملليمولار من الكالسيوم. قم بإعداد الثقافات الفرعية عن طريق تخفيف الثقافة الليلية من واحد إلى 1,000 في حجم نهائي قدره 10 مل في قوارير زجاجية سعة 50 مل.

تنمو البكتيريا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز ، 180 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد سلسلة من العاثيات المخففة MR83a في وسط كلوريد الكالسيوم NB. أضف 20 ميكرولترا من العاثية المخففة إلى الثقافة البكتيرية.

قم بإعداد ثقافة تحكم بدون عدوى العاثيات لتكون بمثابة التحكم الإيجابي لنمو الخلايا البكتيرية. ثم قم بزراعة الثقافات عند 37 درجة مئوية مع رج لطيف عند 100 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، حدد قارورة أو اثنتين من قارورة الثقافة التي تم تطهيرها بأعلى تخفيف للعاثية المضافة.

انقل الثقافات إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل. أضف 250 ميكرولترا من الكلوروفورم إلى الأنابيب واخلط المزرعة جيدا عن طريق قلبها. الطرد المركزي للثقافة عند 5 ، 000 مرة G لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة وقم بتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تحضير وسط أجار مرق المغذيات واحتفظ به دافئا في حمام مائي عند 55 درجة مئوية. أضف محلول كلوريد الكالسيوم 0.5 مولار المعقم إلى الوسط إلى التركيز النهائي البالغ 3.6 ملليمول.

صبها في أطباق بتري 90 ملم NB ألواح كلوريد الكالسيوم. قم بإعداد ثقافة ليلية من N315 في خمسة ملليلتر من كلوريد الكالسيوم NB عند 37 درجة مئوية مع الرج. في اليوم التالي ، أضف 10 ميكرولتر من المزرعة الليلية إلى 200 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم NB ووزعها بالتساوي على لوحة كلوريد الكالسيوم NB.

توقف عن الانتشار عندما يكون سطح اللوحة مغطى بالسائل. ثم اترك الطبق يجف لمدة خمس دقائق. قم بعمل تخفيف تسلسلي واحد إلى 10 من العاثية المعدة مسبقا باستخدام وسط كلوريد الكالسيوم NB.

ضع ثلاثة ميكرولترات من كل تخفيف للعاثية على اللوحة المغطاة بالبكتيريا. احتضان الطبق طوال الليل عند 30 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، عد أرقام البلاك واحسب عقم العاثية باستخدام المعادلة التالية.

قم بإعداد المزرعة الليلية ل N315 أو COL أو MU50 ، في خمسة ملليلتر من كلوريد الكالسيوم NB عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 180 دورة في الدقيقة. بعد الزراعة الليلية ، قم بتخفيف العاثية في كلوريد الكالسيوم NB إلى 109 PFU لكل مليلتر. في قارورة زجاجية سعة 50 مليلتر ، اخلطي 500 ميكرولتر من المزرعة الليلية ، و 500 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم NB الطازج ، ومليلتر واحد من العاثية 109 PFU لكل مليلتر.

احتضن الخليط على حرارة 37 درجة مئوية مع رج لطيف بمعدل 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من سترات ثلاثي الصوديوم بنسبة 20٪ إلى الثقافات. استمر في الرج اللطيف لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

قم بإعداد منقوع القلب الذائب في الدماغ أو وسط BHI أجار واحتفظ به في حمام مائي عند 55 درجة مئوية ، وعالج وسط أجار ب 32 ملليغرام لكل لتر من الكلورامفينيكول. ثم انقل خليط العاثيات البكتيريا إلى قارورة سعة 100 مل. أضف 50 مل من أجار BHI الدافئ مع 32 ملليغرام لكل لتر من الكلورامفينيكول ، واخلطه جيدا.

يسكب المزيج في أطباق بتري 90 ملم. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية. واختبر المستعمرات المتولدة، وهي محولات النيارات، من أجل المقاومة، عن طريق نقل المستعمرات إلى ألواح أجار BHI الجديدة المكملة ب 32 ملليغرام لكل لتر من الكلورامفينيكول.

تأكد من وجود جين CFR عن طريق مستعمرة PCR. استزراع الخلية المتلقية طوال الليل ، في خمسة ملليلتر من TSB عند 37 درجة مئوية مع الرج. في صباح اليوم التالي ، انقل 0.5 مل من الثقافة الليلية إلى أنبوب سعة 1.5 مل.

ترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم الخلايا ب 10 ملليلتر من CS2 في أنبوب 50 ملليلتر. بعد ذلك ، تنمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز بمعدل 180 دورة في الدقيقة لمدة ثماني ساعات حتى المرحلة الأسية المتأخرة.

حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط CS2 الطازج. أضف 10 ميكروغرام من البلازميد المنقى أو الحمض النووي الجيني إلى تعليق الخلية.

هز الثقافة بمعدل 180 دورة في الدقيقة. ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسط BHI.

امزج معلق الخلية مع 90 مل من مكمل أجار BHI المذاب مع 32 ملليغرام لكل لتر كلورامفينيكول ، وخمسة ميكروغرام لكل لتر من التتراسيكلين في تجربة التحكم. يسكب المزيج في أطباق بتري مقاس 90 ملم ويبرد بسرعة ويترك الأجار يتصلب. قم بتكرار المستعمرات باستخدام أعواد الأسنان على أطباق تحتوي على مضادات حيوية مناسبة لتأكيد خصائص مقاومتها.

بروتوكول الاقتران مفيد للانتقال داخل الأنواع حيث تم استخدام المكورات العنقودية البشروية كمتبرع ب CFR. وتم استخدام سلالة المكورات العنقودية الذهبية N315 كمتلقي. يسفر البروتوكول المستخدم للانتقال بين الأنواع عن نتائج مماثلة باستخدام نفس الناقل المقترن في مانحين اقترانيين مختلفين.

هذه هي الورقة الأولى التي تم فيها وصف تفاصيل التحول الطبيعي. ستكون المنهجية المقدمة مفيدة للباحث لدراسة انتقال وانتشار مقاومة المضادات الحيوية ، وكذلك المحدد الأساسي في الممرض البشري المكورات العنقودية الذهبية.