وحيدة الخلية التعبير الجيني عن طريق المتعددة RT-QPCR لتوصيف عدم التجانس من السكان اللمفاوية نادر

يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم التعبير عن مجموعة كبيرة من الجينات على مستوى نسيلي. وحيدة الخلية RT-QPCR يؤدي إلى نتائج موثوق بها للغاية مع حساسية قوية لمئات العينات والجينات.

الهدف العام من هذه التجربة هو مراقبة التعبير الجيني المتعدد في الخلايا المفردة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة ، مثل عدم تجانس التوقيعات الجزيئية داخل مجموعة الخلايا ، أو التوقيع الجزيئي النادر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم التوقيعات الجزيئية المحددة التي تحتوي على 48 جينا مختلفا على الأقل في العديد من الخلايا في نفس الوقت.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد مزيج ما قبل التضخيم ل 48 تفاعلا في أنبوب 1.5 ملليلتر. أضف إلى الأنبوب 240 ميكرولترا من المخزن المؤقت للنسخ العكسي المحدد ، و 62.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت منخفض EDTA TE ، و 9.6 ميكرولتر من بوليميراز Taq DNA. باستخدام ماصة إلكترونية، قم بتوزيع 6.5 ميكرولتر من مزيج التضخيم المسبق على كل بئر من 48 بئرا في صفيحة وحيدة الخلية مكونة من 96 بئرا.

بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج فحص 0.2x في أنبوب 1.5 ملليلتر. أضف إلى الأنبوب 1.4 ميكرولتر من كل برايمر. اضبط مستوى الصوت النهائي على 140 ميكرولتر مع مخزن مؤقت منخفض EDTA TE.

باستخدام ماصة إلكترونية، قم بتوزيع 2.5 ميكرولتر من مزيج الفحص 0.2x على 48 بئرا في لوحة الفرز أحادية الخلية المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على مزيج ما قبل التضخيم. ختم اللوحة بغشاء غطاء. دوامة الطبق ، وقم بتدويرها في 280 مرة جم لمدة دقيقة واحدة.

سيتم فرز الخلايا اللمفاوية الفطرية الكبدية المفردة ، أو ILCs ، عن طريق فرز الخلايا التي يتم تنشيطها بالفلورة. ابدأ هذا الإجراء باستخدام صفيحة فارغة سعة 96 بئرا كاختبار. ضع لوحة الاختبار على حامل اللوحة مع بئر على اليسار ونحو المجريب.

اضبط حامل اللوحة للحصول على قطرة في وسط البئر مع حبات التحقق. عند ضبطها بشكل صحيح ، ضع لوحة الفرز أحادية الخلية المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على مزيج الفحص والتضخيم المسبق على حامل اللوحة. ارسم تخطيط اللوحة ، وفرز خلية واحدة لكل بئر من السكان المسورين.

الوضع الصحيح لكل خلية على لوحة الفرز أحادية الخلية المكونة من 96 بئرا أمرا ضروريا ، ويجب الاحتفاظ بتخطيط اللوحة على برنامج جدول بيانات. اترك بئرا واحدا يحتوي على مزيج فحص 0.2x ومزيج ما قبل التضخيم بدون خلايا ، كعنصر تحكم بدون إدخال. اختياريا ، اترك صفين من ستة آبار لتخفيف (كدنا) كعناصر تحكم لكفاءة التمهيدي.

مباشرة بعد فرز الخلية المفردة ، قم بالدوامة والدوران لأسفل لوحة الفرز أحادية الخلية المكونة من 96 بئر. ضع اللوحة في الدراجة الحرارية. قم بإجراء النسخ العكسي والتضخيم المسبق كما هو موضح.

مطلوب التضخيم المسبق للجينات المستهدفة المحددة على الخلايا المفردة التي تم فرزها من أجل الحصول على مادة كافية. قم بتخفيف العينات المضخمة مسبقا عن طريق إضافة 36 ميكرولترا من المخزن المؤقت منخفض EDTA TE إلى كل بئر. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد 191 ميكرولترا من Master Mix عن طريق سحب 175 ميكرولترا من qPCR Master Mix، و17.5 ميكرولترا من كاشف تحميل العينة في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

على طبق جديد مكون من 96 بئرا ، قم بتوزيع 3.6 ميكرولتر من Master Mix على كل بئر من 48 بئرا. هذه هي لوحة العينة المكونة من 96 بئر. انقل 2.9 ميكرولتر من (كدنا) المضخم مسبقا من لوحة الفرز أحادية الخلية المكونة من 96 بئرا إلى لوحة العينة الجديدة المكونة من 96 بئرا ، مع الحفاظ على نفس الموضع لكل عينة بين اللوحين

قم بإعداد لوحة فحص مكونة من 96 بئرا عن طريق توزيع ثلاثة ميكرولترات من كاشف تحميل الفحص على كل من 48 بئرا على صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا. أضف ثلاثة ميكرولترات من الاشعال إلى كل بئر. يعد الوضع الصحيح لكل برايمر في لوحة الفحص المكونة من 96 بئرا أمرا ضروريا.

احتفظ بتخطيط لوحة على برنامج جدول بيانات. لبدء هذا الإجراء ، ضع دائرة الموائع الدقيقة المتكاملة ، أو IFC ، على المقعد ، وافحص الصمامات باستخدام حقنة. قم بإزالة غطاء المحقنة ، وضعه بشكل عمودي على صمام واحد ، واضغط بقوة.

يجب أن تتحرك الحلقة O. املأ الرقاقة بسائل خط التحكم. بعد تكرار الخطوات السابقة باستخدام الصمام الثاني ، قم بإزالة الفيلم الأسود من أسفل الشريحة.

قم بتحميل الشريحة في وحدة تحكم IFC. على شاشة وحدة تحكم IFC، حدد prime، ثم قم بتشغيله. بعد ذلك ، قم بإخراج الرقاقة ، وأعد إغلاق الفيلم الأسود في الجزء السفلي من الشريحة.

باستخدام ماصة ثماني القنوات، انقل خمسة ميكرولترات من لوحة الفحص المكونة من 96 بئر إلى الجانب الأيسر أو الجانب الأيسر من الشريحة. تغيير النصائح لكل بئر من الشريحة. تجنب إنشاء فقاعات ، وإذا ظهرت فقاعات ، فاستخدم 10 أطراف ميكرولتر لإزالتها.

املأ الجانب الأيسر من الشريحة كما هو موضح. بنفس الطريقة ، املأ الجانب الأيمن من الشريحة باستخدام خمسة ميكرولترات من لوحة العينة المكونة من 96 بئر. لنجاح هذه التجربة ، من الضروري ملء شريحة IFC بشكل صحيح للتحميل المناسب في وحدة التحكم IFC.

قم بإزالة الفيلم الأزرق من أسفل الشريحة ، وقم بتحميل الشريحة في وحدة التحكم IFC. على شاشة وحدة تحكم IFC، حدد تحميل mix، ثم قم بتشغيله. عند الانتهاء ، أخرج الرقاقة ، وأعد إغلاق الفيلم الأزرق في الجزء السفلي من الشريحة.

لتشغيل الشريحة، حدد أولا برنامج جمع البيانات على كمبيوتر qPCR الموائع الدقيقة. بمجرد أن يبدأ ، حدد تشغيل جديد. حدد إخراج وتحميل الشريحة.

بعد إعداد البرنامج كما هو موضح في بروتوكول النص، حدد بدء التشغيل. سيستغرق التفاعل حوالي 90 دقيقة. لبدء تحليل البيانات ، افتح برنامج تحليل PCR في الوقت الفعلي ، وحدد الملف ، وافتحه ، وابحث عن مجلد التجربة ، وحدد رقاقة تشغيل dot b m ملف واحد.

انقر فوق عرض التحليل وجدول النتائج وعرض الخريطة اللونية. المربعات المميزة بعلامة x أقل من مستوى الكشف عن العتبة ، و / أو لديها منحنيات تضخيم سيئة. قم بتسمية العينات.

انتقل إلى نموذج الإعداد وحدد SBS 96 جديد. انقر فوق رسم الخرائط ، وحدد تخطيط العينة وفقا لتخطيط لوحة العينة المكونة من 96 بئرا. انسخ نموذج تصميم تخطيط اللصق من برنامج جدول البيانات.

حدد التخطيط الملصق كاسم عينة. استخدم نفس الإجراء لتسمية المقايسات. أدخل أسماء التمهيدي في إعداد الكاشف، وحدد التخطيط الملصق كاسم كاشف.

انقر فوق عرض التحليل وتحليله. حدد ملف، وقم بالتصدير، واحفظه كنتائج خريطة حرارية. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تم فرز مجموعات ILC الكبدية بناء على علامات ILC المعبر عنها على نطاق واسع ، وتم تحديد ثلاثة مجموعات متميزة.

يجب أن تظهر رقاقة تعبير جيني متعددة الخلية محملة بشكل صحيح بخطوط وصفوف مستقيمة ، مع ملء كل غرفة تفاعل وفي نفس البعد. ستحتوي الشريحة المحملة بشكل غير صحيح على خطوط فارغة وصفوف من غرف التفاعل ، بالإضافة إلى خطوط الانحناء. يظهر شكل أميديت الفلورسين هذا لشريحة محملة بشكل صحيح اختلافات في سطوع غرفة التفاعل تظهر بعد بضع دورات.

تبدو غرف التفاعل ذات إشارة التضخيم أكثر إشراقا من غرف التفاعل التي لا تحتوي على إشارات تضخيم أو إشارات تضخيم منخفضة. بعد الفرز الصحيح للخلايا ، والتضخيم المسبق ، والتحميل ، بدا سكان ILC غير متجانسين للتعبير الجيني في كبد الفئران البرية البالغة. على اليسار خريطة حرارية بدون تعديلات.

على اليمين توجد خريطة الحرارة المعدلة التي تم الحصول عليها بعد تعريف اسم العينة والمقايسة. باستخدام البرامج عبر الإنترنت ، تم تحديد توقيعات التعبير الجيني الخاص بالخلية والعلاقات بين مجموعات الخلايا. يمثل كل سطر جينا ، ويمثل كل صف نفس الخلية ، ويتم تمثيل مجموعات الخلايا الثلاثة باللون الأزرق والأحمر والأخضر.

يمكن إتقان هذه التقنية في تسع ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تتبع اتجاه اللوحة بعناية لتوزيعات الخلايا والتمهيدي. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحث لاستكشاف التوقيعات الجزيئية النادرة والمحددة في مجموعات الخلايا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم التعبير الجيني المتعدد في العديد من الخلايا المفردة في نفس الوقت ، بعد فرز الخلايا المناسب ، والتضخيم المسبق ، والتحميل.