إعداد على نطاق متوسط ​​من ذبابة الفاكهة مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نهج مباشر وغير مكلفة لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط ​​(0.5-1 ز) وإعداد مقتطفات البروتين التي يمكن استخدامها في التطبيقات البروتين المصب، مثل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس ).

الهدف العام من هذه التجربة هو توفير نهج مباشر وغير مكلف لجمع أجنة ذبابة الحب على نطاق متوسط. وإعداد مستخلصات البروتين التي يمكن استخدامها في التطبيقات البروتينية النهائية ، مثل قياس الطيف الكتلي لتنقية التقارب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات إشارات الخلية وعلم الأحياء التنموي.

على سبيل المثال ، كيف تقوم تفاعلات البروتين والبروتين بالاتصال الخلوي أثناء تطور الكائن الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة سهلة وغير مكلفة لتوليد ذبابة الفاكهة تحلل الأجنة. والتي يمكن استخدامها للتطبيقات النهائية مثل تنقية تقارب البروتين.

تقليديا ، قام الباحثون بجمع أجنة ذبابة الفاكهة في أقفاص سكانية كبيرة جدا. لكننا نقدم إجراء سهل الاستخدام لجمع الأجنة في أقفاص متوسطة الحجم يمكن إعدادها بسهولة في أي مختبر. بعد تحضير حاويات سعة خمسة لترات وقطع مربعات 25 × 25 سم من شبكة النايلون ، وفقا لبروتوكول النص ، ضع الشبكة فوق الحاوية واضغط لأسفل بالغطاء.

تأكد من إحكام الشبكة وعدم إمالة الغطاء. القفص جاهز الآن لملء الذباب. بعد تحضير برطمانات بلاستيكية سعة لتر واحد ومربعات شبكية من النايلون مقاس 18 × 18 سم ، ضع الشبكة فوق الحافة العلوية للجرة وقم بتثبيتها على الغطاء لإحكام ربطها.

تأكد من إحكام الشبكة وعدم إمالة الغطاء. تضخيم خطوط الذباب المعدلة وراثيا تحمل البروتين المكتوب محل الاهتمام. وانقل الزجاجات كل يومين حتى يتم تجميع 25 إلى 30 زجاجة لكل خط ذبابة.

تضخيم مخزون التحكم بطريقة مماثلة. بعد ذلك ، قم بتسخين أطباق عصير التفاح إلى درجة حرارة الغرفة. ثم باستخدام إصبع القفاز ، انشر بعض معجون الخميرة المبللة في وسط الأطباق.

عمل دائرة حوالي ستة سنتيمترات للوحة 15 سم. ودائرة أربعة سنتيمترات لصفيحة 10 سنتيمترات. بعد تخدير الذباب ونقله إلى الأقفاص المعدة بحيث تكون الشبكة متجهة لأسفل ، قم بتغطية الأقفاص بأطباق عصير التفاح.

اسمح للذباب بالاستيقاظ. ثم اقلب الأقفاص واحتضان الذباب في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. قم بتغيير الألواح مرتين يوميا ، عن طريق قلب القفص رأسا على عقب ، وأثناء تثبيت اللوحة على القفص ، قم بتقشير الشريط من اللوحة.

اضغط برفق على القفص بأكمله على المقعد واستبدل اللوحة القديمة بسرعة بأخرى جديدة ، محاولا عدم السماح للذباب بالهروب. اسمح للذباب بوضع الأجنة على أطباق عصير التفاح الطازج طوال الليل ، أو لأي فترة زمنية أخرى مرغوبة. في صباح اليوم التالي ، ضع علامة على الحاويات الشبكية ووزنها لجمع الأجنة.

واحد لكل خط ذبابة مستخدم. قم بإعداد 1x Lysis Buffer في أنبوب سعة 50 مليلتر باستخدام الكواشف المصنوعة مسبقا ، عن طريق إضافة 40 مل من الماء إلى 10 مل من محلول التحلل المركز 5x في أنبوب 50 مل. أضف 50 ميكرولترا من DTT دوليا واحدا بتركيز نهائي قدره مليون مول.

تخلط جيدا وتقسم المحلول بين أنبوبين سعة 50 مل. أضف إلى أحد الأنابيب قرصا مثبطا للبروتياز وضع الأنبوب على محور دوار عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

أثناء ذوبان الجهاز اللوحي ، ابدأ في جمع الأجنة عن طريق وضع علامة على أطباق عصير التفاح على الأقفاص ، مع استخدام الأنماط الجينية لخطوط الذباب. واستبدل الأطباق بأخرى طازجة. أضف كمية كافية من الماء لتغطية كل طبق عصير تفاح.

ثم باستخدام فرشاة رسم ناعمة ، قم بإزاحة الأجنة برفق من اللوحة. صب الأجنة في الحاوية الشبكية التي تم وزنها وتمييزها مسبقا واستنزاف الماء الزائد. ثم امسح الشبكة لفترة وجيزة على مناشف ورقية لإزالة الماء الزائد.

لإزالة الأجنة ، املأ نصف طبق بتري بطول ستة سنتيمترات بنسبة 50٪ من المبيض. ثم قم بإعداد طبقين أكبر من بتري بالماء. اغمر الحاوية الشبكية مع الأجنة ، في مبيض بنسبة 50٪ لمدة 90 ثانية.

اضغط برفق على الشبكة أثناء الحضانة عدة مرات ، لتعليق الأجنة في محلول التبييض. في نهاية الحضانة ، استخدم الماء لغسل الحاوية الشبكية في كل طبق من الطبقين ، لمدة 10 ثوان تقريبا. ثم استخدم 18.2 ميغا أوم من الماء في زجاجة بخاخ ، لشطف الحاوية الشبكية جيدا ، بما في ذلك الجوانب والخارج.

لا ينبغي الكشف عن رائحة المبيض بعد الغسيل الشامل. امسح الحاوية الشبكية على مناشف ورقية. ثم قم بوزن الحاوية الشبكية مع الأجنة واطرح وزن الحاوية الفارغة.

سجل الوزن الناتج للأجنة. لتحضير مستخلص الجنين ، أضف ملليلترا واحدا من Lysis Buffer مع مثبطات البروتياز ، إلى الخالط الزجاجي Dounce واحتفظ به على الجليد. ثم انقل الأجنة من الحاوية الشبكية إلى الخالط.

استخدم ملليلترا واحدا من Lysis Buffer لغسل الأجنة المتبقية على الشبكة. وأضف الأجنة والمخزن المؤقت إلى المادة الموجودة في الخالط. ثم دع الأجنة تستقر في قاع الخالط وشفط المادة الطافية بعناية.

بعد ذلك ، أضف Lysis Buffer مع مثبطات البروتياز إلى الخالط ، بهدف الحصول على خمسة إلى ستة ملليلتر من Lysis Buffer لكل جرام من الأجنة. ثم أدخل مدقة فضفاضة لتجانس الأجنة بأربع إلى ست ضربات. خلال السكتات الدماغية الأولى ، سيكون هناك المزيد من المقاومة.

حاول تحريك المدقة بحركة مستمرة لتجنب تناثر المحلول. ثم قم بالتبديل إلى مدقة ضيقة. وتجانس الأجنة بثمانية إلى 10 ضربات.

احتضن المتجانس على الجليد لمدة 20 دقيقة. ثم انقل المتجانس إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. وأجهزة الطرد المركزي عند 13 ، 000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

مع تجنب الكريات الموجودة في الطبقة الدهنية العليا ، انقل المواد الطافية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة على الجليد. بعد تكرار التمركز ، استخدم طرفا واحدا من المليلتر لجمع المواد الطرافية بعناية. ونقلها إلى محاقن مبردة سعة 10 مليلتر مع فلاتر 045 ميكرومتر متصلة.

ادفع كل المحلول إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة على الجليد. قم بتجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية. أو استخدمه على الفور لتجارب تنقية البروتين.

باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو ، تم تحضير Lysates من ذبابة الفاكهة الأجنة التي تعبر في كل مكان عن بروتين EGFP-ERK ، تحت سيطرة مروج الذراع odillo. تم تأكيد التعبير عن البروتين بواسطة Western Blotting لبروتين ERK الكلي للكشف في وقت واحد عن مستويات EGFP-ERK الداخلية والمعدلة وراثيا ، والتي تهاجر عند 42 كيلودالتون و 69 كيلودالتون على التوالي. تم الكشف عن نطاق واحد ، يتوافق مع ERK الداخلي غير الموسوم في خط التحكم الأصفر الأبيض ، مما يؤكد الاستخراج الناجح ل ERK و EGFP-ERK من الأجنة.

لاختبار ما إذا كان بروتوكول الاستخراج مناسبا للتنقية اللاحقة للبروتين الموسوم ، تم إخضاع مقتطفات من ذباب الأصفر الأبيض وذباب arm-EGFP-ERK لتنقية التقارب ، باستخدام حبات GFP Agarose. يظهر تلطيخ الفضة للعينات على SDS-PAGE المتدرج ، تنقية ناجحة لبروتين الطعم EGFP-ERK. إلى جانب EGFP-ERK ، احتوى الممر التجريبي على نطاقات إضافية ، لم يتم ملاحظتها في عينة التحكم ، مما يشير إلى أن التنقية استعادت البروتينات المتفاعلة المحتملة مع ERK.

بمجرد إتقان ، يمكن جمع الأجنة وخطوات الاستخراج في غضون ساعتين تقريبا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تنفيذ خطوات الاستخراج على الجليد. واستخدام مثبطات الإنزيم البروتيني لتقليل تدهور البروتين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد أقفاص سكانية ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط. وصنع مستخلصات بروتين الخلية الكاملة من الأجنة.