Name: إعداد على نطاق متوسط من ذبابة الفاكهة مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: تعلم طريقة فعالة لإعداد مستخلصات بروتينية من أجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط لاستخدامها في تطبيقات البروتوميكس مثل تقنية التطهير التوافقي-طيف الكتلة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يشكر المؤلفون أعضاء مختبر فيراكسا على تعليقات مفيدة حول المخطوطة واقتراحات لتحسين البروتوكول. تم دعم أف من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM105813 و NS096402. وقد دعم لي من جامعة ماساتشوستس بوسطن سانوفي جنزيمي الدكتوراه زمالة.

<ol><li>Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+developmental+processes%3A+insights+from+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).</li>
<li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction%3A+mass+spectrometry-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).</li>
<li>Arbeitman, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+during+the+life+cycle+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster.</a> Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).</li>
<li>Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transcription+of+the+Drosophila+engrailed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene.</a> Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).</li>
<li>Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soluble+nuclear+fraction%2C+a+highly+efficient+transcription+extract+from+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos.</a> Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).</li>
<li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+in+Drosophila%3A+The+advantages+of+the+GS-TAP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system.</a> Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).</li>
<li>Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+large+quantities+of+Drosophila+for+biochemical+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments.</a> Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).</li>
<li>Sisson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+large+populations+of+Drosophila+for+protein+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Caravaca, J. M., Lei, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+a+Drosophila+melanogaster+Population+Cage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minibrain+and+Wings+apart+control+organ+growth+and+tissue+patterning+through+down-regulation+of+Capicua%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).</li>
<li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stringent+analysis+of+gene+function+and+protein-protein+interactions+using+fluorescently+tagged+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes.</a> Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).</li>
<li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).</li>
<li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Notch+signalling+by+non-visual+beta-arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin.</a> Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).</li>
<li>Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screen+for+Conditional+Growth+Suppressor+Genes+Identifies+the+Drosophila+Homolog+of+HD-PTP+as+a+Regulator+of+the+Oncoprotein+Yorkie%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie.</a> Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).</li>
<li>Anjum, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Toll+Signaling+and+Inflammation+by+beta-Arrestin+and+the+SUMO+Protease+Ulp1%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1.</a> Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).</li>
<li>Degoutin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riquiqui+and+minibrain+are+regulators+of+the+hippo+pathway+downstream+of+Dachsous%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous.</a> Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecdysone+receptor+coactivator+Taiman+links+Yorkie+to+transcriptional+control+of+germline+stem+cell+factors+in+somatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue.</a> Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).</li>
<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-autonomous%2C+ubiquitous+marker+for+the+analysis+of+Drosophila+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics.</a> Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).</li>
<li>Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos.</a> J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).</li>
<li>Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+isolate+ubiquitin+conjugates+reveals+wide+role+for+ubiquitination+during+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).</li>
<li>Ramirez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+the+Ubiquitin+Landscape+in+the+Drosophila+Embryonic+Nervous+System+and+the+Adult+Photoreceptor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells.</a> PLoS One. 10 (10), 0139083(2015).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

بروتوكول المقدمة هنا هو إجراء بسيط وعمومي لإعداد أقفاص السكان ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط، وجعل مقتطفات البروتين خلية كاملة من الأجنة. ويمكن استخدام مقتطفات الناتجة في مجموعة متنوعة من التطبيقات المصب، مثل تنقية المجمعات البروتين على راتنجات تقارب. فمن الأهمية بمكان لأداء خطوات استخراج على الجليد واستخدام تثبيط البروتيني قوية، للحد من تدهور البروتين. كما هو موضح، والبروتوكول هو مناسبة لعزل معظم سيتوبلازميك وبعض الغشاء والبروتينات النووية القابلة للذوبان <sup class="xref"...

الشاشات الجينية، ومؤخرا، النهج الجينومية ثورة في دراسة الوظائف البيولوجية. ومع ذلك، يتم ترميز المعلومات الخلوية الهامة في البروتينات ومجموعتها من الشركاء المتفاعلين. في حين أن شاشات المعدل الجيني التقليدية يمكن تحديد مكونات مسار الحد من معدل واستعادة التفاعلات غير المباشرة، وقوة النهج البروتين يكمن في قدرتها على تحديد شبكات التفاعل الفوري الكامل للبروتينات ذات الاهتمام. وبالتالي، فإن بروتيوميكس طريقة متعامدة قيمة لدراسة النظم البيولوجية، ويكمل علم الجينوم، ترانسكريبتوميكس، والشاشات الوراثية التقليدية. وقد أثبتت تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس) أن يكون نهجا قويا لدراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي) في بيئتهم الأصلية في الخلايا والأنسجة 1 ، 2 . وتسمح هذه الطريقة بتحديد التفاعلات المباشرة أو غير المباشرة في تطوير معينمراحل أو سياقات الأنسجة، وقد استخدمت بنجاح لتحديد متعددة مؤشرات الأداء القياسية الرواية في مجموعة متنوعة من المسارات التنموية (استعرض في المرجع 1 ). على الرغم من النجاح الذي لا جدال فيه لدراسات مؤشر أسعار المنتجين، معظمها قد نفذت في الخلايا المستزرعة، حيث تم الإفراط في التعبير عن البروتينات &quot;الطعم&quot; من الفائدة. هناك نوعان من القضايا مع دراسة مؤشر أسعار المنتجين في زراعة الخلايا: أولا، قد لا يوفر خط خلية محددة مجموعة كاملة من التفاعلات بسبب عدم التعبير عن بعض البروتينات. ثانيا، أوفيركسريسيون عالية عادة ما تستخدم في مثل هذه التحليلات قد تؤدي إلى القطع الأثرية مثل بروتين ميسفولدينغ أو تحديد تفاعلات إيجابية كاذبة. كل من هذه القيود يمكن التغلب عليها من خلال تحليل مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي . وهناك خطوة محدودة في مثل هذه التجارب هو توافر المواد انطلاق لتنقية المجمعات البروتين. وقد استخدمت منذ فترة طويلة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر كنموذج لتحليل وظيفيوقد ثبت مؤخرا أنه نظام ممتاز لدراسة مؤشرات أسعار المنتجين في الجسم الحي . يمثل تجنين ذبابة الفاكهة نوع الأنسجة جذابة بشكل خاص لدراسة مؤشر أسعار المنتجين، لأن الأجنة يمكن جمعها بسهولة بكميات كبيرة، وأيضا لأن معظم الجينات (&gt; 88٪) يتم التعبير عن مسار التطور الجنيني، وبالتالي توفير غنية في بيئة الجسم الحي للكشف عن ذات الصلة مؤشر أسعار المنتجين 3 . تقليديا، والدراسات البيوكيميائية في الذباب تستخدم جدا على نطاق واسع مجموعات الجنين (100-150 ز)، مثل تلك اللازمة لتنقية ليسيتس النسخي وظيفية 4 ، 5 . الدراسات السابقة أب- مس في ذبابة الفاكهة تحتاج أيضا كميات كبيرة من الأجنة (5-10 ز)، لأنها اعتمدت على نهج تنقية من خطوتين مثل جنبا إلى جنب تنقية تقارب (تاب)، مع فقدان المرتبطة من المواد في كل خطوة 6 . كبير أمونتيسي من المواد البدء في إنشاء مجموعات الجنين في أقفاص سكانية كبيرة، والتي يمكن أن تكون على حد سواء باهظة الثمن (عند شراؤها تجاريا) وتستغرق وقتا طويلا للحفاظ على ونظيفة 7 ، 8 ، 9 . التطورات الأخيرة في تطوير نهج تنقية تقارب خطوة واحدة، فضلا عن حساسية متزايدة من مطياف الكتلة، وخفضت الكمية اللازمة من المواد بدءا من قبل حجم من الحجم. باستخدام علامات مثل الببتيد ستريبتافيدين ملزم (سبب) أو بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) والبدء من أقل من 1 غرام من الأجنة، فمن الممكن لعزل كميات من البروتين الطعم والتفاعل المكونات التي ستكون كافية لتحديد من قبل مطياف الكتلة 10 ، 11 . الهدف من البروتوكول المعروضة هنا هو مساعدة الباحثين أوفيركولي حاجز ينظر إلى التحليل البيوكيميائية من مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي . تحقيقا لهذه الغاية، ونحن نقدم إجراء بسيط وغير مكلفة لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط ​​(0.5-1 ز)، تليها خطوة واحدة إعداد مقتطفات البروتين كامل الخلية التي هي مناسبة لتحليل لاحق من قبل أب-مس أو نهج أخرى . يعتمد أسلوبنا على استخدام 1-L أو 5-L أقفاص السكان حسب الطلب التي يمكن أن تنتج بسهولة من قبل أي مختبر. وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة ظروف الاستخراج المعروضة هنا في العديد من الدراسات، سواء في الخلايا المستزرعة وفي الجسم الحي 10 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 .

<table><tbody><tr><td>Leaktite 5-Qt. حاوية طبيعية متعددة الخلطات (عبوة من 3)</td> <td>هوم ديبوت</td><td>209330</td><td>لصنع أقفاص سعة 5 لتر.</td></tr><tr><td>Leaktite 5-Qt. غطاء طبيعي متعدد المزيج (عبوة من 3)</td><td>هوم ديبوت</td><td>209320</td><td>قطر 8.37 بوصة. أغطية لأقفاص 5 لتر.</td></tr><tr><td>أطباق فيشربراند بتري بغطاء شفاف ، 100 × 15 مم</td><td>FB0875712 فيشر العلمي</td><td></td><td>المادة: بوليسترين. يستخدم مع أقفاص 1 لتر.</td></tr><tr><td>أطباق فيشربراند بتري بغطاء شفاف ، 150 × 15 مم</td><td>FB0875714 فيشر العلمي</td><td></td><td>المادة: البوليسترين. يستخدم مع أقفاص سعة 5 لتر.</td></tr><tr><td>أطباق فيشربراند بتري بغطاء شفاف ، 60 × 15 ملم</td><td>FB0875713A فيشر العلمي</td><td></td><td>المادة: بوليسترين. تستخدم أثناء تفكك الجنين.</td></tr><tr><td>شبكة نايلون سيفر نيتكس</td><td>سيفر</td><td>03-180 / 44</td><td>180 ميكرون ، 44٪ منطقة مفتوحة ، تستخدم لأقفاص الذباب.</td></tr><tr><td>ميلووكي 3 في. منشار ثقب الجرار مع مستودع Arbor</td><td>Home</td><td>Depot 49-56-9670</td><td>أداة قطع مقاس 3 بوصات لصنع أقفاص سعة 1 لتر.</td></tr><tr><td>Nalgene واسعة الفم مستقيمة الوجهين PMP الجرار مع إغلاق المسمار البولي بروبلين الأبيض</td><td>فيشر Scientific</td><td>11-823-33</td><td>لصنع أقفاص 1 لتر. القط العلمي الحراري # 21171000. يمكن استخدام حاويات بديلة سعة 1 لتر.</td></tr><tr><td>الخميرة الجافة النشطة ريد ستار ، 2 رطل كيس</td><td>ريد ستار &nbsp ؛</td><td></td><td>يمكن شراؤها من Amazon.com أو موردين آخرين.</td></tr>مركز <tr><td>عصير التفاح المجمد 100٪&nbsp;</td><td></td><td></td><td>يمكن شراؤها من محل بقالة. يجب أن تقول "عصير تفاح 100٪" على العلبة.</td></tr>يعرف <tr><td>ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات</td><td>Acros Organics</td><td>AC126965000</td><td>أيضا باسم ميثيل بارابين أو تيغوسيبت. تستخدم كمادة حافظة في ألواح AJ.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 للبيولوجيا الجزيئية ، 100 مل</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>تستخدم لإعداد عازلة التحلل.</td></tr><tr><td>وحدات تصفية معقمة سريعة التدفق يمكن التخلص منها من Nalgene مع غشاء CN &nbsp ؛</td><td>فيشر العلمي</td><td>09-740-2A</td><td>0.2 & م حجم المسام. تستخدم لتصفية 5x تحلل المخزن المؤقت. القط العلمي الحراري # 1260020.</td></tr><tr><td>كوكتيل CO-RO ROCHE كوكتيل</td><td>سيجما</td><td>11697498001</td> مثبط البروتياز <td>من 20 قرصا. تستخدم لتثبيط الإنزيم البروتيني في عازلة التحلل.</td></tr><tr><td>مرشحات حقنة Corning SFCA&nbsp;</td><td>فيشر Scientific</td><td>09-754-21</td><td>غشاء SFCA ، قطر 26 مم ، حجم المسام 0.45 مو م. تستخدم لتصفية عينات المستخلصات النهائية.</td></tr><tr><td>BD&nbsp; محاقن Luer-Lok التي تستخدم لمرة واحدة بدون إبر</td><td>فيشر Scientific</td><td>14-823-2A</td><td>لتصفية عينات المستخلصات النهائية. BD القط # 309604.</td></tr>يمكن <tr><td>شراء Bleach</td><td>Clorox</td><td></td><td>المستخدم في تفكيك الأجنة بنسبة 50٪ (حجم / حجم) في الماء ، من أي سوبر ماركت. من المهم استخدام ماركة كلوركس ، حيث قد تؤدي العلامات التجارية الأخرى إلى عدم اكتمال الكسرة أو قد تكون سامة للأجنة.</td></tr><tr><td>لوحات Corning Costar Netwell Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-213</td><td>حاويات شبكية لمجموعات الأجنة. 74 مو ؛ م حجم شبكة ، 6 بئر.</td></tr><tr><td>مطاحن المناديل من Wheaton Dounce ، سعة 15 مل</td><td>الخالط Fisher Scientific</td><td>06-435B</td><td>للأجنة ، مع مدقات فضفاضة وضيقة. قطة ويتون # 357544.</td></tr></tbody></table>

إعداد على نطاق متوسط ​​من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

أصبح تحليل التفاعلات البروتينية البروتين نهجا لا غنى عنه لدراسة العمليات والآليات البيولوجية، مثل إشارات الخلية، وتطوير الكائن الحي، والمرض. وغالبا ما يكون من المرغوب فيه للحصول على معلومات مؤشر أسعار المنتجين باستخدام في الجسم الحي المواد، للحصول على وجهة نظر الأكثر طبيعية وغير منحازة من شبكات التفاعل. ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر هو منصة ممتازة لدراسة مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي ، ويتيح نفسه لنهج واضحة لعزل المواد للتجارب البيوكيميائية. على وجه الخصوص، تمثل الأجنة ذبابة الفاكهة نوع مناسب من الأنسجة لدراسة مؤشر أسعار المنتجين، ويرجع ذلك إلى سهولة جمع الحيوانات في هذه المرحلة التنموية وحقيقة أن غالبية البروتينات وأعرب في التطور الجنيني، وبالتالي توفير بيئة ذات صلة للكشف عن معظم مؤشر أسعار المنتجين. هنا نقدم بروتوكول لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط ​​(0.5-1 ز)، وهو مبلغ مثالي لمجموعة واسعة منتطبيقات البروتين، بما في ذلك تحليل مؤشر أسعار المنتجين من قبل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس). نحن تصف تصاميمنا ل 1 L و 5 L أقفاص لمجموعات الجنين التي يمكن أن تكون بسهولة وتكلفة اقامة في أي مختبر. ونحن نقدم أيضا بروتوكول عام لجمع الجنين واستخراج البروتين لتوليد ليسيتس التي يمكن استخدامها مباشرة في التطبيقات المصب مثل أب-مس. هدفنا هو توفير وسيلة متاحة لجميع الباحثين لتنفيذ تحليلات مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي .

لتوضيح استخدام هذا البروتوكول في تجربة تنقية معقدة البروتين، أنشأنا خط متماثل قابلة للحياة ذبابة، الذراع إغف- إرك، معربا عن إغف الموسومة ذبابة الفاكهة خارج الخلية ينظم إشارة كيناز (إرك، المشفرة من قبل الجينات توالت ) تحت السيطرة من المدرع أعرب عنها في كل مكان ( الذراع ) المروج 18 ، 19 . الذراع المروج نشط خلال م...

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نهج مباشر وغير مكلفة لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط ​​(0.5-1 ز) وإعداد مقتطفات البروتين التي يمكن استخدامها في التطبيقات البروتين المصب، مثل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس ).

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

يتمثل الهدف العام من هذه التجربة في توفير نهج بسيط وغير مكلف لجمع أجنة ذبابة الفاكهة (Drosophila) على نطاق متوسط، وتحضير مستخلصات بروتينية يمكن استخدامها في تطبيقات البروتيوميات اللاحقة، مثل مطيافية الكتلة للتنقية التقاربية. ومن شأن هذه الطريقة أن تساعد في الإجابة عن أسئلة جوهرية في مجالات تأشير الخلايا والبيولوجيا التنموية.على سبيل المثال، كيف تقوم بروتينات محددة وتفاعلات بروتينية بتنفيذ التواصل الخلوي أثناء تطور الكائن الحي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها طريقة سهلة وغير مكلفة لتحضير مستخلص تحلل أجنة Drosophila، والذي يمكن استخدامه في تطبيقات لاحقة مثل التنقية الألفينية للبروتين.تقليدياً، كان الباحثون يجمعون أجنة Drosophila في أقفاص ذات مجموعات سكانية كبيرة جداً. لكننا نقدم إجراءً سهلاً لجمع الأجنة في أقفاص متوسطة الحجم يمكن إعدادها بسهولة في أي مختبر. بعد تحضير حاويات سعة خمسة لتر وقص مربعات من شبكة النايلون بمقاس 25 في 25 سنتيمتر، وفقاً للبروتوكول المكتوب، ضع الشبكة فوق الحاوية واضغط عليها باستخدام الغطاء.تأكد من أن الشبكة مشدودة وأن الغطاء غير مائل. أصبح القفص الآن جاهزاً لاستقبال الذباب. بعد تجهيز البرطمانات البلاستيكية سعة لتر واحد ومربعات شبكة النايلون مقاس 18 by 18 centimeter، ضع الشبكة فوق الحافة العلوية للبرطمان وأحكم ربط الغطاء لتثبيتها.تأكد من أن الشبكة محكمة وأن الغطاء غير مائل. قم بتكثير سلالات الذباب المعدلة وراثياً التي تحمل البروتين المستهدف المحدد. وقم بنقل الزجاجات كل يومين حتى يتراكم من 25 إلى 30 زجاجة لكل سلالة ذباب.قم بتكثير مخزون ضابط بطريقة مماثلة. بعد ذلك، قم بتدفئة أطباق عصير التفاح حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. ثم باستخدام إصبع يرتدي قفازاً، قم بتوزيع بعض معجون الخميرة الرطب في مركز الأطباق.صنع دائرة يبلغ قطرها ستة سنتيمترات تقريبًا لطبق قطره 15 سنتيمترًا، ودائرة بقطر أربعة سنتيمترات لطبق قطره 10 سنتيمترات. بعد تخدير الذباب ونقله إلى الأقفاص المجهزة بحيث يكون المشبك متجهًا للأسفل، غطِّ الأقفاص بأطباق عصير التفاح.اترك الذباب حتى يستيقظ. بعد ذلك، اقلب الأقفاص واحضن الذباب في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين يومين إلى ثلاثة أيام. قم بتغيير الأطباق مرتين يومياً، عن طريق قلب القفص رأساً على عقب، ومع تثبيت الطبق بالقفص، قم بنزع الشريط اللاصق من الطبق.انقر بلطف على القفص بالكامل فوق طاولة المختبر واستبدل الطبق القديم بآخر جديد بسرعة، مع الحرص على عدم السماح للذباب بالهروب. اترك الذباب يضع الأجنة على أطباق عصير التفاح الطازجة طوال الليل، أو لأي فترة زمنية أخرى مطلوبة. وفي الصباح التالي، قم بتمييز ووزن الحاويات الشبكية المخصصة لجمع الأجنة.واحد لكل خط ذباب مستخدم. قم بتحضير محلول منظم للتحلل (Lysis Buffer) بتركيز 1x في أنبوب سعة 50 milliliter باستخدام كواشف تم تحضيرها مسبقاً، وذلك بإضافة 40 milliliters من الماء إلى 10 milliliters من محلول منظم للتحلل بتركيز 5x في أنبوب سعة 50 milliliter. أضف 50 microliters من DTT بتركيز one molar ليصل التركيز النهائي إلى one mili molar.امزج المكونات جيداً وقسّم المحلول على أنبوبين سعة كل منهما 50 milliliter. أضف قرصاً واحداً من مثبط البروتياز (protease inhibitor tablet) إلى أحد الأنبوبين، ثم ضع الأنبوب على جهاز تدوير (rotator) عند درجة حرارة 4 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة.بينما يذوب القرص، ابدأ في جمع الأجنة عن طريق وضع علامات على أطباق عصير التفاح الموجودة في الأقفاص، مع تحديد الأنماط الجينية لسلالات الذباب المستخدمة. ثم استبدل الأطباق بأخرى جديدة. أضف كمية كافية من الماء لتغطية كل طبق من أطباق عصير التفاح.بعد ذلك، وباستخدام فرشاة رسم ناعمة، قم بإزالة الأجنة بلطف من الطبق. صب الأجنة في حاوية شبكية موزونة ومميزة مسبقاً، وقم بتصريف المياه الزائدة. ثم جفف الشبكة لفترة وجيزة باستخدام مناشف ورقية لإزالة المياه الزائدة.لإزالة الغشاء الكوريوني من الأجنة، املأ نصف طبق بتري سعة ستة سنتيمتر بمحلول مبيض بتركيز 50%. ثم جهز طبقين بتري أكبر يحتويان على الماء. اغمر الحاوية الشبكية التي تحتوي على الأجنة في محلول المبيض بتركيز 50% لمدة 90 ثانية.انقر برفق على الشبكة أثناء فترة التحضين عدة مرات، لتعليق الأجنة في محلول المبيض. وفي نهاية فترة التحضين، استخدم الماء لغسل حاوية الشبكة في كل من الطبقين، لمدة 10 ثوانٍ تقريبًا. بعد ذلك، استخدم ماءً بنقاوة 18.2 megohm centimeter في زجاجة رش، لشطف حاوية الشبكة تمامًا، بما في ذلك الجوانب والجهة الخارجية.يجب ألا يتم اكتشاف أي رائحة للمبيض بعد الغسل الجيد. جفف الحاوية الشبكية باستخدام مناشف ورقية. ثم قم بوزن الحاوية الشبكية بما تحتويه من أجنة واطرح منها وزن الحاوية الفارغة.سجل الوزن الناتج للأجنة. لتحضير مستخلص الأجنة، أضف 1 mL من Lysis Buffer مع مثبطات البروتياز إلى مجانس زجاجي من نوع Dounce وحافظ عليه في الثلج. ثم انقل الأجنة من الحاوية الشبكية إلى المجانس.استخدم 1 mL من محلول التحلل (Lysis Buffer) لغسل الأجنة المتبقية على الشبكة. ثم أضف الأجنة والمحلول إلى المادة الموجودة في المتجانس (homogenizer). بعد ذلك، اترك الأجنة تترسب في قاع المتجانس وقم بسحب السائل الطافي بعناية.بعد ذلك، أضف محلول التحلل (Lysis Buffer) المحتوي على مثبطات البروتياز إلى المجانس، بحيث تهدف إلى إضافة من 5 إلى 6 مل من محلول التحلل لكل جرام من الأجنة. ثم أدخل مدقة غير محكمة لتجانس الأجنة من خلال إجراء من أربع إلى ست ضربات. ستلاحظ وجود مقاومة أكبر خلال الضربات الأولى.حاول تحريك المدقة بحركة مستمرة لتجنب تطاير المحلول. ثم استبدلها بمدقة محكمة الإغلاق، وقم بتجنيس الأجنة بثمان إلى 10 ضربات.يتم تحضين المتجانس على الثلج لمدة 20 دقيقة. ثم يُنقل المتجانس إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة. ويُجرى الطرد المركزي عند 13,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة.أثناء تجنب الرواسب الموجودة في الطبقة الدهنية العلوية تماماً، انقل السوائل الطافية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة على الثلج. وبعد تكرار عملية الطرد المركزي، استخدم طرف ماصة سعة 1 milliliter لجمع السوائل الطافية بعناية، ثم انقلها إلى محاقن سعة 10 milliliter مبردة ومزودة بمرشحات 0.45 micrometer.انقل جميع المحلول إلى أنابيب طرد مركزي مجهرية سعة 2 مل ومصنفة على الثلج. قم بتجميد العينات تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل وخزنها عند درجة حرارة 80- درجة مئوية، أو استخدمها فوراً في تجارب تنقية البروتين.باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو، تم تحضير مستخلصات من أجنة Drosophila التي تعبر بشكل شامل عن بروتين EGFP-ERK، تحت تحكم محفز arm-odillo. تم التأكد من تعبير البروتين عن طريق تقنية Western Blotting لبروتين ERK الكلي للكشف المتزامن عن مستويات ERK الداخلي وEGFP-ERK المعدل وراثياً، حيث هاجرا عند 42 kilodaltons و69 kilodaltons على التوالي. تم الكشف عن حزمة واحدة، تقابل ERK الداخلي غير المسمى في سلالة التحكم yellow white، مما يؤكد نجاح استخلاص ERK وEGFP-ERK من الأجنة.لاختبار ما إذا كان بروتوكول الاستخلاص مناسباً للتنقية اللاحقة للبروتين المسمى، خضعت مستخلصات من ذباب yellow white، وarm-EGFP-ERK، للتنقية بالألفة، باستخدام GFP Agarose Beads. ويظهر صبغ الفضة للعينات التي تم تشغيلها على SDS-PAGE متدرج نجاح تنقية بروتين الطعم EGFP-ERK. وبالإضافة إلى EGFP-ERK، احتوى الممر التجريبي على حزم إضافية، لم تُلاحظ في عينة الضبط، مما يشير إلى أن عملية التنقية استعادت بروتينات محتملة متفاعلة مع ERK.بمجرد إتقان العملية، يمكن إتمام خطوات جمع الأجنة والاستخلاص في غضون ساعتين تقريبًا. وأثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تنفيذ خطوات الاستخلاص على الثلج، واستخدام مثبطات البروتياز لتقليل تحلل البروتين.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إعداد أقفاص مجموعات Drosophila على نطاق متوسط، وكيفية تحضير مستخلصات البروتين من الخلايا الكاملة للأجنة.

medium-scale-preparation-drosophila-embryo-extracts-for-proteomic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

نحن تصف عملية لترسيخ وتثبيت ، sectioning ، والتصوير من مرحلة...

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

نحن تصف الإجراء الذي قام...

التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

نحن هنا وصف كامل الفلورسنت...

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

مجمعات البروتين متعدد العناصر تلعب دورا حاسما خلال وظيفة الخلوية والتنمية. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل المجمعات البروتين الأصلي من أجنة ذبابة الفاكهة في الجسم الحي بعد يشابك تليها تنقية المجمعات crosslinked لاحقة تحليل هيكل وظيفة.

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

إدخال جزيئات صغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين تقدم إمكانية كبيرة للتميز النشاط البيولوجي لمركبات جديدة، والمخدرات، والسموم، وكذلك لبحث مسارات التنموية الأساسية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة الخطوط العريضة الخطوات التي تغلب على الحواجز الطبيعية لهذا النهج، وتوسيع المنفعة من طراز الجنين ذبابة الفاكهة.

A طريقة Permeabilization من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة للفحوصات الصغيرة جزيء آخر

ترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) قادرة على التقاط الترجمة الخاصة بنوع الخلية ل mRNA. نبلغ هنا عن أول بروتوكول TRAP مخصص لعزل mRNA في مجموعات الخلايا النادرة من أجنة ذبابة الفاكهة.

TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

هذا العمل تفاصيل طريقة المناعية القياسية لتصور توقعات الخلايا العصبية الحركية من أواخر المرحلة 16 الأجنة ميلانوجاستر ذبابة الفاكهة . إعداد فيليه من الأجنة ثابتة ملطخة الأجسام المضادة فاسي يوفر أداة قوية لتوصيف الجينات المطلوبة لمحور محور عصبي باثفيندينغ والاعتراف الهدف خلال التنمية العصبية.

التصور من محور الإسقاط نمط من الخلايا العصبية المحرك الجنينية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

يتم تقديمها هنا هو بروتوكول لmicroinject وفي وقت واحد صورة الأجنة Drosophila متعددة خلال النمو الجنيني باستخدام لوحة المستندة إلى، صورة عالية المحتوى.

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

هنا ، نصف بروتوكولا للكشف عن بروتين جنين ذبابة الفاكهة والحمض النووي الريبي وتوطينهما من الجمع إلى التضمين المسبق والتضمين ، والتلطيخ المناعي ، وتهجين الحمض النووي الريبوزي المرسال في الموقع .

بروتوكول للكيمياء النسيجية المناعية وتوزيع الحمض النووي الريبي في الموقع داخل جنين ذبابة الفاكهة المبكر

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتنفيذ الفحص المجهري التوسعي في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتحقيق تصوير فائق الدقة باستخدام مجهر متحد البؤر تقليدي للمسح بالليزر.

استخدام الفحص المجهري التوسعي لتكبير أجنة ذبابة الفاكهة المثبتة بالكامل جسديا للحصول على تصوير فائق الدقة

يصف هذا البروتوكول وضع العلامات الفلورية المخصصة القائمة على الأجسام المضادة وحقنها في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتمكين التصوير المباشر للبروتينات منخفضة الوفرة أو التعديلات اللاحقة للترجمة التي يصعب اكتشافها باستخدام أساليب GFP / mCherry-tag التقليدية.

تصور البروتينات منخفضة الوفرة والتعديلات اللاحقة للترجمة في أجنة ذبابة الفاكهة الحية عن طريق حقن الأجسام المضادة الفلورية

تعلم طريقة فعالة لإعداد مستخلصات بروتينية من أجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط لاستخدامها في تطبيقات البروتوميكس مثل تقنية التطهير التوافقي-طيف الكتلة.

إعداد على نطاق متوسط ​​من

استكشف المزيد من الفيديوهات

إعداد على نطاق متوسط من