التمييز وتوصيف السكان غير المتجانسة باستخدام تقنيات التصوير الكمي

الهدف العام من هذه المنهجية هو التقييم الكمي للاستجابات المظهرية الديناميكية للمجتمعات الخلوية غير المتجانسة تجاه الاضطرابات مع التمييز بين المجموعات الفرعية. تحدث معظم التفاعلات الفسيولوجية في ظل وجود أنواع متعددة من الخلايا. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد علماء بيولوجيا الخلية في تقييم كيفية استجابة الخلايا غير المتجانسة لضغوط بيئية متطابقة وكيفية تأثير الأنواع المختلفة على بعضها البعض.

تتميز هذه التقنية بعدة مزايا، حيث تفرق بين أنواع متعددة من الخلايا، وتسمح بالتحليل المتزامن للمجموعات الفرعية بما في ذلك معدلات الولادة والوفاة والديناميكيات المورفولوجية. وبينما يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة العديد من العمليات البيولوجية، سنقوم بتوضيح سير العمل باستخدام خلايا الورم H3255 وخلايا الأرومة الليفية CCD19LU المعالجة بـ Erlotinib، وهو دواء علاج كيميائي. للبدء، وبعد تحضير معلقات الخلايا في أنابيب وفقاً للبروتوكول المكتوب، اقلب الأنابيب لخلط الخلايا في المحلول لتوحيد عملية الاستزراع.

بعد ذلك، انقل 10 µL من كل معلق خلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، وأضف 10 µL من صبغة trypan blue. ثم انقل 10 µL من المحلول إلى شريحة عد الخلايا وأدخل الشريحة في جهاز عد الخلايا الآلي. كرر عملية عد الخلايا ثلاث مرات على الأقل، أو حتى يتم الحصول على نتائج عد متسقة.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بستزراع ما مجموعه 1,500 خلية في 100 µL من وسط RPMI في آبار طبق زراعة يحتوي على 96 بئراً. وزع كل معلق خلوي في ثلاث مكررات مع اعتماد إعدادات متطابقة للطبق لكل نقطة زمنية. احضن الخلايا طوال الليل.

أضف DMSO إلى مسحوق Erlotinib لتحضير محلول مخزون من Erlotinib بتركيز 10 millimolar. بعد ذلك، استخدم وسط زراعة الخلايا لتخفيف الدواء إلى ضعف أعلى تركيز نهائي وهو 10 micromolar. قم بإجراء تخفيف تسلسلي للدواء أربع مرات بنسبة 1:10، للحصول على خمس تراكيز مختلفة من الدواء ومجموعة ضابطة خالية من الدواء.

انقل 100 µL من محلول الدواء إلى الآبار المناسبة في طبق الخلايا ذو الـ 96 بئراً، بحيث يكون التركيز النهائي للدواء 1x مخففاً في الوسط الزرعي. بعد ذلك، ولصبغ الخلايا من أجل التصنيف المعتمد على الفلورة، قم بتحضير صبغة نووية بتركيز 5 µg/mL وصبغة للخلايا الميتة بتركيز 5 µM في محلول PBS. أما بالنسبة للتصنيف المعتمد على المورفولوجيا، فقم بتحضير صبغة نووية بتركيز 5 µg/mL، وصبغة للخلايا الميتة بتركيز 5 µM، وصبغة خلوية بتركيز 5 µM في محلول PBS.

أضف 20 µL من محلول الصبغة إلى كل بئر. بعد ذلك، قم بتحضين العينات عند 37 °C في مكان محمي من الضوء لمدة 30 دقيقة. وللحصول على الصور، استخدم ethanol بتركيز 70% لمسح قاع الطبق، ثم ضع الطبق في غرفة التصوير.

في علامة تبويب الإعداد (set up) ضمن اختيار القناة (channel selection)، انقر على زر الزائد لإضافة القنوات المناسبة إلى الصورة. وفي اختيار المخطط (layout selection)، قم بضبط مجموعة صور متتالية في المحور z (z stack) لصور اختبار كل 2 microns، بدءاً من 0 microns وانتهاءً عند 20 microns، لتحديد مستوى التركيز. انقر على لقطة (snapshot) تحت كل قناة لتقييم الكثافة وتحسين أوقات التعريض.

أدخل قيمًا أعلى أو أقل في حقل الوقت حسب الحاجة. يجب أن تكون نوى الخلايا في بؤرة التركيز لضمان دقة التحليل اللاحق. قم بتحديد الآبار المناسبة في المخطط التوضيحي للصفيحة.

بعد ذلك، في المخطط التوضيحي للآبار، قم بتحديد الـ 25 حقلًا المراد تصويرها بطريقة مماثلة. وتحت قسم "تشغيل التجربة" (run experiment)، حدد الطبق في خانة "اسم الطبق" (plate name)، ثم انقر فوق زر البدء (start) لتشغيل بروتوكول الحصول على الصور باستخدام عدسة شيئية 10x لإنشاء صور TIFF بتدرج رمادي في القنوات المختارة. بعد تثبيت البرمجيات مفتوحة المصدر، CellProfiler وCellProfiler analysis، افتح برنامج CellProfiler، وانقر فوق "ملف" (File)، ثم "استيراد" (Import)، ثم "مسار من ملف" (Pipeline from file) واختر الملف المناسب.

اختر مسار التصنيف القائم على الفلورة لتصنيف الخلايا كخلايا H3255 أو CCD19LU بناءً على شدة EGFP وحساب سمات المورفولوجيا. انقر فوق "عرض إعدادات المخرجات"، ثم حدد موقع ملفات الصور المراد تحليلها ووجهة البيانات المستخرجة. قبل إجراء التحليل، يجب اختبار البروتوكول في وضع الاختبار للتحقق من قيم المعاملات.

من المهم أن تكون عملية تقسيم النوى والخلايا دقيقة. صُمم هذا البروتوكول لتحديد الخلايا ذات صبغات النوى المتفاوتة، ولضمان أن تكون قيمة البكسل التي يتم من خلالها توسيع النوى كبيرة بما يكفي لتغطية النوى ذات الصبغة الأعلى للحمض النووي DNA، ولكن صغيرة بما يكفي لعدم تغطية النوى المحيطة. ولتصنيف المجموعات بناءً على الفلورة، قم أولاً بإعادة تحجيم نطاق شدة GFP، ثم قم بقياس شدة GFP لكل نواة تم تحديدها وتصنيف الكائنات بناءً على عتبة يحددها المستخدم.

بعد ذلك، انقر فوق "analyze images" لبدء التحليل. وعند اكتمال التحليل، انتقل إلى مجلد المخرجات الافتراضي لعرض البيانات المحسوبة. وبالنسبة للتصنيف القائم على المورفولوجيا، قم بتشغيل البروتوكول المناسب في cell profiler لإنشاء سمات المورفولوجيا للخلية بأكملها.

افتح برنامج تحليل Cell Profiler، وحدد ملف خصائص قاعدة البيانات الذي تم إنشاؤه في Cell Profiler ثم انقر على فتح. انقر فوق علامة تبويب Classifier في أعلى يسار الشاشة. لاستدعاء صور خلايا عشوائية من التجربة، انقر فوق fetch، وستظهر الصور في نافذة unclassified.

صنف الخلايا يدويًا كإيجابية أو سلبية، والتي تمثل هنا H3255 أو CCD19LU، وذلك عن طريق تحديد الخلايا وسحبها إلى الحاوية المناسبة. بعد تصنيف 50 خلية على الأقل لكل مجموعة فرعية، انقر فوق "Train Classifier" (تدريب المصنف) ثم انقر فوق "Check Progress" (التحقق من التقدم). وأخيرًا، انقر فوق "Score All" (تسجيل الكل) لإنشاء جدول يحتوي على أعداد الخلايا لكل مجموعة فرعية.

في مزرعة باردة غير متجانسة الخلايا مكونة من خلايا الورم H3255 وخلايا CCD19LU الليفية، تم تحديد النوى وتقسيمها بناءً على صبغ الحمض النووي DNA. وصُنفت المجموعات الخلوية إما عن طريق الفلورة المستحثة اصطناعياً أو من خلال التدريب على خوارزمية تعلم الآلة لتحديد أنواع الخلايا بناءً على الاختلافات المورفولوجية. وهناك تطابق عالٍ بين المنهجيات القائمة على الفلورة وتلك القائمة على المورفولوجيا.

تم تطبيق طريقتي التصنيف بشكل مستقل على الصور ذاتها، وكان هناك تطابق بنسبة 97.4% و 92.5% في المجموعات غير المعالجة والمعالجة على التوالي. هنا، تم استقصاء التغيرات في مورفولوجيا الخلايا والاستجابة للعلاج بعقار Erlotinib. فبعد ثلاثة أيام من العلاج الدوائي، لوحظ انخفاض في مساحة النوى وزيادة في المساحة الخلوية في خلايا H3255.

ربما كان ذلك بسبب موت الخلايا. ولاختبار ما إذا كان لـ Erlotinib تأثير سام للخلايا أو مثبط لنموها، تم تحديد الخلايا الميتة بناءً على صبغ يوديد البروبيديوم. وقد لوحظ وجود تأثيرات سامة للخلايا ومثبطة لنموها لـ Erlotinib على خلايا H3255، مع زيادة في عدد الوفيات وانخفاض في عدد الولادات بعد العلاج بالدواء.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في ساعتين غير متتاليتين إذا أُجريت بشكل صحيح. وعقب هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل تداخل الحمض النووي الريبوزي (RA interference) أو نظام CRISPR للإجابة على أسئلة إضافية تبحث في الجينوميات الوظيفية. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السرطان لاستكشاف تأثير الخلايا السدوية على تطور الورم في أنواع متعددة من السرطانات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة الاستجابات متباينة الخلايا للمنبهات البيئية، وتحديداً كيفية تحليل بيانات التصوير القائمة على المجهر بطريقة عالية الإنتاجية.