التمييز وتوصيف السكان غير المتجانسة باستخدام تقنيات التصوير الكمي
June 30th, 2017
قمنا بتطوير بروتوكول جديد لدراسة الديناميات السكانية غير المتجانسة في الاستجابة للاضطرابات. تصف هذه المخطوطة منصة تعتمد على التصوير تنتج مجموعات بيانات كمية لتوصيف في وقت واحد من المظاهر الخلوية متعددة من السكان غير المتجانسة بطريقة قوية.
الهدف العام لهذه المنهجية هو التقييم الكمي للاستجابات المظهرية الديناميكية لمجموعات الخلايا غير المتجانسة للأنابيب مع التمييز بين المجموعات السكانية الفرعية. تحدث معظم التفاعلات الفسيولوجية في وجود أنواع متعددة من الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة علماء الأحياء الخلوية على تقييم كيفية استجابة الخلايا غير المتجانسة للضغوط البيئية المتطابقة وكيف تؤثر الخلايا المختلفة على بعضها البعض.
تتمتع هذه التقنية بالعديد من المزايا ، فهي تميز بين أنواع الخلايا المتعددة ، وتسمح بالتحليل المتزامن للمجموعات السكانية الفرعية بما في ذلك معدلات المواليد والوفيات والديناميكيات المورفولوجية. بينما يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة العديد من العمليات البيولوجية ، سنوضح تدفق العمل باستخدام الخلايا السرطانية H3255 وخلايا الخلايا الليفية CCD19LU المعالجة ب Erlotinib ، وهو دواء علاج كيميائي. للبدء ، بعد تحضير معلقات الخلايا في الأنابيب وفقا لبروتوكول النص ، قم بقلب الأنابيب لخلط الخلايا في محلول لتوحيد البذر.
ثم قم بتقطيع 10 ميكرولترات من كل معلق خلية في أنبوب طرد مركزي صغير ، وأضف 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. ماصة 10 ميكرولترات من المحلول في شريحة عد الخلايا وأدخل الشريحة في عداد خلية آلي. كرر عدد الخلايا ثلاث مرات على الأقل، أو حتى تصبح الأعداد التي تم الحصول عليها متسقة.
باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بزرع ما مجموعه 1،500 خلية في 100 ميكرولتر من RPMI في آبار صفيحة 96 بئر. قم بوضع كل تعليق خلية في ثلاث نسخ مع إعدادات لوحة متطابقة لكل نقطة زمنية. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها.
أضف DMSO إلى مسحوق Erlotinib لعمل محلول مخزون Erlotinib سعة 10 ملليمول. بعد ذلك ، استخدم وسط زراعة الخلايا لتخفيف الدواء إلى أعلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومولار. قم بتخفيف الدواء بشكل متسلسل أربع مرات بنسبة 1:10 ، ليصبح المجموع خمسة تركيزات للأدوية وعدم التحكم في المخدرات.
ماصة 100 ميكرولتر من محلول الدواء في الآبار المناسبة للوحة الخلايا البالغة 96 بئر للحصول على تركيز نهائي للدواء يبلغ 1x مخفف في المتوسط. ثم لتلطيخ الخلايا للتصنيف القائم على التألق ، قم بإعداد خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من البقع النووية وخمسة بقع خلايا ميتة ميكرومولار في PBS. للتصنيف القائم على التشكل ، قم بإعداد خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من البقع النووية ، وخمسة بقع خلايا ميتة ميكرومولار وخمسة صبغة خلايا ميكرومولار في PBS.
أضف 20 ميكرولترا من محلول الصبغة إلى كل بئر. بعد ذلك ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة. للحصول على الصور ، استخدم 70٪ من الإيثانول لمسح الجزء السفلي من اللوحة ووضع اللوحة في غرفة التصوير.
في علامة التبويب "إعداد" ضمن تحديد القناة، انقر فوق زر علامة الجمع لإضافة القنوات المناسبة إلى الصورة. ضمن تحديد التخطيط، قم بتعيين مكدس z من صور الاختبار كل ميكرون، بدءا من صفر ميكرون وينتهي عند 20 ميكرون، لتحديد مستوى التركيز. انقر فوق لقطة، أسفل كل قناة لتقييم الشدة وتحسين أوقات التعرض.
أدخل قيما أعلى أو أقل ضمن الوقت كما هو مطلوب. يجب أن تكون النوى في الخلايا في بؤرة التركيز من أجل ضمان دقة التحليل النهائي. على اللوحة التخطيطية ، قم بتسليط الضوء على الآبار المناسبة.
ثم في تخطيط الآبار ، قم بتمييز 25 حقلا ليتم تصويرها بطريقة مماثلة. ضمن تجربة التشغيل ، حدد اللوحة في اسم اللوحة ، ثم انقر فوق زر البدء لتشغيل بروتوكول الحصول على الصور بهدف 10x لإنشاء صور TIFF بتدرج الرمادي في القنوات المختارة. بعد تثبيت البرامج مفتوحة المصدر ، تحليل CellProfiler و CellProfiler ، افتح CellProfiler ، انقر فوق ملف ، استيراد ، خط أنابيب من الملف وحدد الملف المناسب.
حدد خط أنابيب التصنيف القائم على التألق لتصنيف الخلايا على أنها إما H3255 أو CCD19LU بناء على شدة EGFP ولحساب ميزات التشكل. انقر فوق ، عرض إعدادات الإخراج ، ثم حدد موقع ملفات الصور للتحليل والوجهة للبيانات المستخرجة. قبل تشغيل التحليل ، يجب اختبار البروتوكول في وضع الاختبار للتحقق من قيم المعلمات.
من المهم أن يكون التجزئة النووية والخلوية دقيقة. تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد الخلايا ذات صبغة النوى المختلفة ، والتأكد من أن قيمة البكسل التي يتم من خلالها توسيع النوى ، كبيرة بما يكفي لإخفاء النوى بأعلى صبغة من الحمض النووي ، ولكنها صغيرة بما يكفي لعدم إخفاء النوى المحيطة. لتصنيف المجموعات السكانية بناء على التألق ، أولا ، قم بإعادة قياس نطاق شدة GFP ، ثم قم بقياس شدة GFP لكل نواة محددة وتصنيف الكائنات بناء على عتبة محددة من قبل المستخدم.
بعد ذلك ، انقر فوق تحليل الصور لبدء التحليل. عند اكتمال التحليل ، انتقل إلى مجلد الإخراج الافتراضي لعرض البيانات المحسوبة. للتصنيف القائم على التشكل ، قم بتشغيل البروتوكول المناسب في ملف تعريف الخلية لإنشاء ميزات مورفولوجيا الخلية بأكملها.
افتح برنامج تحليل محلل ملفات تعريف الخلية، وحدد ملف خصائص قاعدة البيانات الذي تم إنشاؤه في محلل ملفات تعريف الخلية وانقر فوقه، افتح. انقر فوق علامة التبويب مصنف في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة. لاستدعاء صور الخلايا العشوائية من التجربة، انقر فوق إحضار، وستظهر الصور في النافذة غير المصنفة.
قم بتصنيف الخلايا يدويا على أنها موجبة أو سلبية ، والتي تمثل هنا H3255 أو CCD19LU عن طريق تحديد الخلايا وسحبها إلى الحاوية المناسبة. بعد تصنيف 50 خلية على الأقل لكل مجموعة سكانية فرعية، انقر فوق Train Classifier ثم انقر فوق التحقق من التقدم. أخيرا ، انقر فوق ، سجل الكل لإنشاء جدول يحتوي على عدد الخلايا لكل مجموعة سكانية فرعية.
في مزرعة باردة غير متجانسة الخلايا للورم H3255 وخلايا الخلايا الليفية CCD19LU ، تم تحديد النوى وتجزئتها بناء على تلطيخ الحمض النووي. تم تصنيف مجموعات الخلايا إما عن طريق التألق المستحث بشكل مصطنع أو التدريب على خوارزمية التعلم الآلي لتحديد أنواع الخلايا بناء على اختلافات التشكل. هناك توافق كبير بين المنهجيات القائمة على التألق والمورفولوجيا.
تم تضمين طريقتي التصنيف بشكل مستقل على نفس الصور واتفقت بنسبة 97.4٪ و 92.5٪ على المجموعات السكانية غير المعالجة والمعالجة على التوالي. هنا ، تم التحقيق في التغييرات في مورفولوجيا الخلية والاستجابة لعلاج إرلوتينيب. بعد ثلاثة أيام من العلاج بالعقاقير ، لوحظ انخفاض في مساحة النوى وزيادة في المنطقة الخلوية من خلايا H3255.
ربماكان هذا بسبب موت الخلايا. لاختبار ما إذا كان Erlotinib له تأثير سام للخلايا أو تثبيط الخلايا على الخلايا ، تم تحديد الخلايا الميتة بناء على تلطيخ يوديد البروبيديوم. لوحظ كل من التأثيرات السامة للخلايا والخلايا للإيرلوتينيب على خلايا H3255 ، مع زيادة في عدد الوفيات وانخفاض في عدد المواليد بعد العلاج بالعقاقير.
بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ساعتين غير متتاليتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تداخل RA أو CRISPR من أجل معالجة أسئلة إضافية تبحث في علم الجينوم الوظيفي. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السرطان لاستكشاف تأثير الخلايا اللحمية على تطور الورم في أنواع متعددة من السرطان.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة استجابات الخلايا غير المتجانسة للمنبهات البيئية ، وتحديدا كيفية تحليل بيانات التصوير القائمة على الفحص المجهري بطريقة إنتاجية عالية.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا جديدًا للتحقيق في ديناميكيات السكان متعددة الخلايا استجابةً للاضطرابات. تعتمد المنهجية على منصة قائمة على التصوير لتوليد مجموعات بيانات كمية لتصنيف الأنماط الظاهرية متعددة الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات التصوير
- ديناميكيات السكان
الخلفية
- غالبًا ما تحدث التفاعلات الفسيولوجية بين أنواع متعددة من الخلايا.
- من المهم فهم كيفية استجابة الخلايا غير المتجانسة للضغوط البيئية.
- تتيح هذه الطريقة تقييم التفاعلات بين مجموعات خلوية مختلفة.
- يمكن تطبيقها على عمليات بيولوجية مختلفة.
هدف الدراسة
- لتقييم الكمي للردود الظاهرية الديناميكية للمجموعات متعددة الخلايا.
- للتمييز بين المجموعات الفرعية في ظل ظروف متطابقة.
- لتوضيح سير العمل باستخدام أنواع خلوية وعلاجات محددة.
الطرق المستخدمة
- تحضير معلقات الخلايا وتوحيد البذر.
- استخدام الأزرق الترايباني لعد الخلايا والتحليل الآلي.
- العلاج الدوائي باستخدام الإيرلوتينيب وتلطيخ الفلوريسcencia للتصنيف.
- اكتساب الصور وتحليلها باستخدام برنامج CellProfiler.
النتائج الرئيسية
- توافق عالي بين المنهجيات القائمة على الفلوريسcencia والمورفولوجيا.
- دقة تصنيف 97.4٪ و92.5٪ للمجموعات غير المعالجة والمعالجات، على التوالي.
- تحديد ناجح وفصل نواة الخلايا استنادًا إلى التلطيخ.
الاستنتاجات
- يمكن للبروتوكول التمييز بشكل فعال بين أنواع متعددة من الخلايا.
- يمكنه تحليل المجموعات الفرعية في وقت واحد، بما في ذلك معدلات الولادة والموت.
- يمكن تكييف هذه المنهجية لدراسات بيولوجية مختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively dissect heterogeneous cell population responses to drug perturbations, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology and stromal-tumor interaction studies. By distinguishing subpopulations via fluorescence or morphology, it provides predictive confidence in compound effects on specific cellular compartments, informing go/no-go decisions in early discovery. The approach reduces assay variability and reagent consumption while increasing throughput for phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying subpopulation-specific responses to perturbations.
- Operational Value: Discriminates between cell types using fluorescence intensity or morphology, clarifying pathway contributions in co-culture systems.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing differential drug effects on tumor versus stromal compartments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative phenotypic readouts including morphology changes, proliferation, and apoptosis for each subpopulation.
- Operational Value: Standardizes seeding and staining protocols to ensure reproducibility across wells and time points.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and automated imaging for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase phenotypic responses to preclinical validation by tracking birth/death rates and morphological dynamics.
- Mechanistic De-risking: Isolates stromal influence on tumor progression, reducing ambiguity in target mechanism interpretation.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of imaging-based morphology shifts with functional outcomes for translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing subpopulation-resolved data that informs mechanistic understanding and compound prioritization before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how heterogeneous cells respond to identical environmental pressures and influence one another.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized cell counting, drug dilution, and staining protocols that enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Outputs segmentation, classification, and feature extraction data (nuclei area, cellular area, death rates) that allow teams to compare conditions quantitatively.
- Translational Research: Connects early phenotypic responses to stromal-tumor interactions, informing preclinical models of cancer progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline applicable to diverse co-culture systems and perturbation types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through deconvolution of mixed population responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced reagent use versus traditional assays.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by revealing cytotoxic/cytostatic effects on specific subpopulations.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on differential effects in tumor and stromal compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image analysis, and CellProfiler pipeline configuration.
- Dependent on automated imaging hardware capable of z-stack acquisition and multi-channel fluorescence detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and classification thresholds for fluorescence or morphology-based methods.
- Adaptation to new model systems may require optimization of nuclear/cellular segmentation parameters and classifier training.
- Practical limitations include challenges in identifying populations with complex morphological features, necessitating troubleshooting as noted in the protocol.
