وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

الهدف العام من هذا الإجراء هو ملاحظة تأثير معالجات محددة ذات أهمية على هجرة الخلايا في ساند فيبرين ثلاثي الأبعاد مرتبط بالجروح. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التئام الجروح، حول كيفية تأثير التغييرات في بنية شبكة الألياف على هجرة الخلايا إلى خثرات الفيبرين في مواقع الجروح، وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لتحليل هجرة الخلايا داخل خثرات الفيبرين في شكل ثلاثي الأبعاد. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن نقل الكريات الخلوية قد يكون أمراً شاقاً.

ابدأ بتدفئة أنبوبة تحتوي على أرومات ليفية جلدية بشرية حديثة الولادة مجمدة في حمام مائي درجة حرارته 37 °C. بمجرد إذابة الخلايا، قم بجمعها عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الراسب في وسط زراعة أرومات ليفية جلدية بشرية حديثة الولادة طازج بتركيز 1 x 10⁶ خلية/ملل. ثم ازرع الخلايا في دورق زراعة T75 للحضن لمدة 72 ساعة عند درجة حرارة 37 °C و5% CO2.

عندما تصل المزرعة إلى درجة تلاحم بنسبة 80%، قم بفصل الخلايا باستخدام خمسة ملليلتر من trypsin EDTA. بعد مرور خمس دقائق عند 37 °C، قم بتعادل الـ trypsin باستخدام خمسة ملليلتر من الوسط الدافئ، ثم اخلط 40 µL من الخلايا مع trypan blue بنسبة 1:1. احتفظ بعينة قدرها 10 µL من الخلايا لغرض العد.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الراسب بتركيز 1.25 x 10⁵ خلية لكل milliliter. بعد ذلك، غطِّ قاع طبق بتري بقطر 10 centimeter بخمسة milliliters من PBS المعقم. ثم اقلب غطاء طبق بتري وأضف قطرات متعددة بحجم 20 µL من معلق الخلايا على السطح الداخلي للغطاء.

بعد وضع جميع القطرات، أعِد قلب الغطاء فوق الطبق، مع الحرص على عدم زعزعة القطرات المعلقة، ثم ضع الطبق برفق في حاضنة عند درجة حرارة 37 degree celsius لمدة 72 ساعة. في نهاية فترة التحضين، أضف 100 microliters من محلول التجلط لكل كروية في كل بئر، في طبق مكون من 48 بئراً، ورج الطبق ونقر عليه برفق لضمان تغطية خليط جلطة الفيبرين للبئر بالكامل. ضع الطبق في الحاضنة لمدة ساعة واحدة.

عندما تتبلمر طبقة التجلط، تحقق من وجود الكريات (spheroids) في مستنبت القطرة المعلقة تحت المجهر الضوئي، وانقل صفيحة الـ 48 بئراً وطبق مستنبت القطرة المعلقة إلى خزانة زراعة الخلايا. اقلب غطاء طبق بيتري بعناية للوصول إلى مستنبتات القطرة المعلقة، واستخدم حقنة سعة 1 ml مزودة بإبرة قياس 21 gauge لنقل قطرة واحدة إلى كل بئر مطلي بالفبرين. يجب توخي الحذر الشديد عند سحب وزرع الكريات، حيث أن الخطوة الأكثر صعوبة وحرجاً في هذه العملية هي نقل الكريات دون تدميرها.

افحص الطبق تحت المجهر للتأكد من أن الكريات قد تم استزراعها بشكل صحيح في الآبار المناسبة. أضف بحذر 100 µL من محلول التجلط المُحضّر حديثاً فوق كل قطرة تحتوي على كرية، وأعد فحص الكريات تحت المجهر للتأكد من أنها لا تزال سليمة وفي مركز كل بئر. بعد ذلك، أعد الطبق ذو الـ 48 بئراً إلى الحاضنة للسماح للطبقة الثانية من الفبرين بالبلمرة.

بعد مرور ساعة واحدة، يتم معالجة كل بئر بـ 500 microliters من الوسط المناسب لمجموعة الكريات التجريبية المقابلة، ثم تُعاد الطبقة إلى الحاضنة عند درجة حرارة 37 degree celsius. يتم التقاط صور للكريات باستخدام مجهر المجال المضيء كل 24 إلى 72 ساعة، مع استخدام ميزة z stack لعرض المقاطع العرضية المتتالية للمستنبت الخلوي ثلاثي الأبعاد. بعد ذلك، وباستخدام برنامج تحليل الصور المناسب، يتم تتبع حدود الخلايا لكل كرية عند كل نقطة زمنية متتالية، واستخدام وظيفة القياس لحساب النسبة المئوية للزيادة في مساحة كل كرية.

بعد استزراعها في العامل المحفز أو المثبط للهجرة الخلوية قيد الدراسة، يمكن تحديد المساحات الأولية للكرويات عن طريق التصوير المجهري بالمجال المضيء، واستخدامها كمرجع لتحديد درجة نمو الخلايا اللاحق خارج أجسام الكرويات عند كل نقطة زمنية متتالية. وفي هذه التجربة النموذجية، أظهرت الكرويات التي تعرضت لعامل محفز للهجرة زيادة ملحوظة في درجة الهجرة بعيداً عن جسم الكروية الأصلي مقارنة بالكرويات التي تعرضت لعامل مثبط للهجرة أو لعامل تحكم. وعلى العكس من ذلك، أظهرت الكرويات التي تعرضت لعامل مضاد للهجرة انخفاضاً ملحوظاً في درجة الهجرة بعيداً عن جسم الكروية الأصلي، مقارنة بالكرويات المعالجة بعامل التحكم.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ساعتين ونصف، باستثناء وقت استنبات الخلايا، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استنبات وتضمين الكريات الخلوية لإجراء اختبارات هجرة الخلايا ثلاثية الأبعاد في المختبر (in vitro). وباتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التحليل النسيجي والكيمياء النسيجية المناعية للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية ارتباط بنية شبكة الفيبرين داخل الجلطة أو محاذاة الأكتين في الخلايا الكروية بزيادة أو نقصان هجرة الخلايا.

لا تنسَ أن العمل مع المزارع الخلوية والإبر قد يكون خطيراً للغاية، وأنه يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية المناسبة والعمل داخل غطاء زراعة معقم، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.