مجهرية على أساس أساليب التقييم للهجرة الخلية الظهارية أثناء التئام الجرح في المختبر

الهدف العام من إجراءات الجرح الاصطناعي لزراعة الخلايا الظهارية هو دراسة هجرة الخلايا من منظور كمي ونوعي ، مما يسمح بتقييم آثار العلاجات المحددة ذات الأهمية على التئام الجروح. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التئام الجروح ، لأنها تسمح بالتوصيف الدقيق لأدوار عمليات الهجرة المحددة أثناء الاضطراب الظهاري. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي أنه يسمح بارتباط قياسات هجرة الخلايا بالتغيرات في سلوك العلامات الجزيئية ذات الصلة.

يمتد تأثير هذه التقنيات إلى علاج الجروح السريرية ، لأنها توفر إعدادا مناسبا لاختبار الأدوية المبكر وإغلاق الجروح. بشكل عام في هذه الطريقة ستبدأ بسبب الصعوبات في الحصول على قابلية التكاثر المتسقة في الجروح مع جيل. للحصول على فحص خدش الجرح الاصطناعي ، ابدأ ببذر كل بئر من صفيحة الاستزراع بملليلترين من الخلايا الظهارية ذات الأهمية في وسط كامل.

استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى التقاء 100٪. عندما تصبح الخلايا جاهزة ، اغسل الخلايا مرتين بوسط طازج خال من المصل متبوعا ب 24 ساعة من المزرعة في وسط طازج خال من المصل. في اليوم التالي ، ضع اللوحة في منطقة عمل معقمة واسحب الطرف الضيق لطرف ماصة دقيقة معقمة عبر قاع كل بئر مرتين لتوليد جرح متقاطع.

يتم تحقيق فجوة ثابتة في الجرح عن طريق تطبيق ضغط ثابت وثابت مع تحريك الطرف بسلاسة على طول السطح الظهاري. سيؤدي الضغط المفرط إلى تشويه الطرف ، مما يتسبب في عدم انتظام نصف قطر الجرح. قم بإزالة المادة الطافية برفق للتخلص من الخلايا المنفصلة وإضافة وسط جديد خال من المصل بعناية إلى الآبار.

باستخدام مجهر تباين الطور المقلوب المتصل بكاميرا جهاز مقترنة بالشحن ، قم بمحاذاة حافة مجال المجهر مع التقاطع المجاور للخدوش للحصول على ما يصل إلى أربع صور مرجعية للمعالجة المسبقة لفجوة الخدش في كل بئر. عندما يتم الحصول على جميع الصور ، استبدل الوسط الموجود في آبار المعالجة المخصصة بوسط جديد ، مع استكماله بعلاجات مختارة ذات أهمية وأعد الألواح إلى حاضنة زراعة الخلايا. عندما تصل حالة واحدة على الأقل إلى حوالي 90٪ من إغلاق فجوة الخدش ، استبدل المادة الطافية برفق بمليلتر واحد من الفورمالين بنسبة أربعة بالمائة في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسل الخلايا برفق باستخدام PBS ثلاث مرات على الأقل لإزالة أي فورمالين زائد وتصوير الآبار كما هو موضح للتو ، باستخدام نفس معلمات التصوير في المناطق المرجعية الأصلية التي تم التقاطها بعد الخدش. لتحليل الصور باستخدام برنامج معالجة الصور المناسب ، افتح الصورة المسجلة والمعالجة المسبقة ذات الاهتمام وتحت قائمة الصورة ، اضبط نوع الصورة على 8 بت. ضمن القائمة عملية، حدد القائمة الفرعية عوامل التصفية وقم بتطبيق تصفية التباين.

ضمن قائمة الصورة ، افتح القائمة الفرعية ضبط واضبط العتبة على أبيض وأسود. في القائمة Process، حدد القائمة الفرعية Binary وقم بتطبيق Fill Holes. ضمن قائمة التحليل، حدد تعيين القياسات وقم بتنشيط المنطقة.

ثم ارسم المنطقة القابلة للقياس ، باتباع محيط الحافة المهاجرة لتحديد الفجوة. ضمن القائمة تحليل، حدد تحليل الجسيمات وسجل قيم المساحة الإجمالية لسطح المنطقة المرسومة. لتحديد الهجرة المطلقة لكل مجموعة من العينات الفردية كفرق بين قياسات سطح الفجوة ، قم بتصدير قيم مساحة سطح الفجوة الإجمالية قبل المعالجة وما بعدها إلى جدول بيانات ورسم مخرجات القياس الكمي.

لاختبار أمامية للهجرة الاصطناعية ، في ظل ظروف معقمة ، أضف طبقة واحدة من ما يصل إلى 33 غطاء دائري معقم في ألواح استزراع فارغة بحجم 10 سنتيمترات. عندما يتم تغطية سطح اللوحة بالكامل ، قم بزرع الخلايا الظهارية ذات الأهمية برفق بتركيز يسمح بالتقاء بنسبة 100٪ بعد يومين أو ثلاثة أيام من الزراعة. إذا لزم الأمر ، اضغط برفق على الأغطية بطرف ماصة دقيقة معقمة لمنع الطفو.

عندما تصل الخلايا إلى التقاء ، استبدل المادة الطافية بوسط خال من المصل لمدة 24 ساعة أخرى من الزراعة. بعد ذلك ، استخدم الغطاء المعقم لنقل غطاء واحد بعناية إلى صفيحة جديدة بطول 10 سم تحتوي على وسط جديد خال من المصل ، مع الحرص على تثبيت الغطاء على طول محيطه. لإنشاء الجروح الاصطناعية ، اسحب شفرة حلاقة معقمة ذهابا وإيابا عبر كل غطاء لعمل خط عرضي من ثلاثة إلى أربعة ملليمترات فوق مركز كل ثقافة خلية لإزالة الشريط المركزي أحادي الطبقة تماما.

احرص على وضع حافة شفرة الحلاقة بكثافة على سطح الغطاء عند عمل الجرح للحماية من شكل الحافة غير المنتظم وتوليد الأجزاء الظهارية المتقليبة. انقل ما يصل إلى أربعة أغطية الجرح ، بحيث يكون جانب الخلية لأعلى ، إلى آبار فردية من ستة آبار ، تحتوي على ملليلترين على الأقل من الوسط الخالي من المصل وغسل كل بئر برفق مرتين بوسط جديد خال من المصل لإزالة أي خلايا منفصلة. عندما يتم التخلص من جميع الخلايا المنفصلة ، استبدل وسط الغسيل برفق بوسط جديد مكمل بالعلاجات ذات الأهمية ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا.

في نهاية الفترة التجريبية المناسبة ، قم بإصلاح الخلايا بنسبة أربعة بالمائة من الفورمالين في PBS كما هو موضح للتو ، وصمة عار الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة الفلورية المناسبة ذات الأهمية. ثم قم بتصوير التغييرات الهيكلية التي تحدث عند الحافة الأمامية المهاجرة بواسطة المجهر الفلوري وفقا للمعايير التجريبية ذات الأهمية. في هذه التجربة ، تم قياس فجوات الجرح قبل وبعد العلاج بعامل نمو البشرة ، وهو محفز معروف لتكاثر الخلايا الظهارية وهجرتها.

ثم تم حساب الهجرة المطلقة على أنها الفرق بين مساحات سطح الفجوة قبل وبعد المعالجة. يعمل العلاج بعامل نمو البشرة على تحفيز ديناميكيات الهيكل الخلوي للخلية كما لوحظ في صور الفحص المجهري بالمسح بالليزر لتلوين F-Actin للخلايا المحفزة لعامل التحكم والنمو. علاوة على ذلك ، لوحظ الإفراط في التعبير عن c-Jun مع زيادة التعبير عن البروتين الظاهر في الخلايا المجاورة للجبهة المهاجرة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من سلامة حواف الجرح بحثا عن وجود سدائل الخلايا الظهارية التي قد تعطل القياس الكمي للهجرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التقييم الكمي والنوعي لسلوك الهجرة