التحديد الكمي للكائنات الحية الدقيقة في تركيزات منخفضة باستخدام المجهر المجسم الرقمي (DHM)

الهدف العام من هذه التجربة هو إثبات اكتشاف الكائنات الحية الدقيقة عند مستويات منخفضة جدا باستخدام الفحص المجهري المجسم الرقمي. هذه التقنية أكثر حساسية من الفحص المجهري الضوئي التقليدي وتوفر معلومات في الوقت الفعلي حول السلوكيات البكتيرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجالات البيولوجية والكونية مثل البحث عن الكائنات المسببة للأمراض في الماء أو الحياة داخل نظامنا الشمسي على الأقمار الجليدية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن DHM هي تقنية حجمية مما يعني أنه يمكننا التقاط معلومات ثلاثية الأبعاد على عينتنا على الفور دون الحاجة إلى إعادة التركيز جسديا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص مجرى الدم أو التهابات السائل النخاعي بسبب القدرة على اكتشاف التركيزات البكتيرية المنخفضة. لبدء هذا الإجراء ، في يوم التجربة ، خذ قراءة طيفية للثقافة الرئيسية للبكتيريا والتي من المتوقع أن تكون في حدود 0.6 إلى 0.7.

ثم خذ عينة من الثقافة الرئيسية وعد الخلايا مباشرة باستخدام غرفة عد بتروف هوسر لتعداد الخلايا الحية والميتة. انقل عينة سعة 10 ميكرولتر من المزرعة غير المخففة باستخدام ماصة دقيقة إلى الغرفة. قم بتصويره تحت مجهر موضوعي عالي الجفاف باستخدام تباين الطور.

بعد ذلك ، عد البكتيريا في 20 مربعا على الأقل وقم بحسابها المتوسط. احسب التركيز بمتوسط 20 مربعا مضروبا في عامل التخفيف. لتعداد الخلايا الحية فقط ، قم بعمل تخفيف تسلسلي لكل عينة من العينات البكتيرية المختارة بمحلول ملحي معقم 0.9٪ عن طريق نقل 20 ميكرولترا من المحلول البكتيري إلى بئر آخر وتخفيفه ب 180 ميكرولتر من المحلول الملحي.

كرر الإجراء حتى يصبح أدنى تركيز حوالي 10 إلى الخلايا الثلاث لكل مليلتر. بعد ذلك ، خذ 100 ميكرولتر من العينات من مخففين على الأقل وقم بوضعها على ألواح الوسائط الصلبة المناسبة. انشرها باستخدام موزعة معقمة وقم بإجراء ثلاث نسخ مكررة على الأقل من كل تخفيف.

بعد ذلك ، احتضنها في درجة حرارة مناسبة طوال الليل أو حتى تنمو المستعمرات. ثم عد المستعمرات. احسب وحدات تكوين المستعمرة ومتوسطها على التكرارات.

في هذا الإجراء ، قم بعمل تخفيفات تسلسلية للثقافة الرئيسية ل DHM وعد ما بعد DHM ل CFU على ألواح وسائط مرق Lysogeny. خفف البكتيريا إلى 25 مل من الحد الأدنى من الوسط الذي سيشجع الحركة ولكنه يمنع انقسام الخلايا بحيث لا يتغير تركيز الخلايا بشكل ملحوظ أثناء التجربة. لتسجيل مقاطع فيديو DHM ، باستخدام حقنة معقمة ، ارسم حوالي 10 ملليلتر من تخفيف الفائدة.

ثم قم بتوصيل المحقنة بغرفة عينة DHM باستخدام تركيبات وأنابيب معقمة. قم بتدفق العينة من المحقنة عبر حجرة العينة بشكل مستمر باستخدام مضخة حقنة. عندما تتدفق العينة عبر غرفة العينة ، احصل على الصور المجسمة على التوالي بمعدل إطارات مناسب.

اترك وقتا كافيا لتدفق 10 ملليلتر من العينة بالكامل عبر DHM. للتأكد من أن البكتيريا لا تنمو أو تموت أثناء التجارب ، قم بتلقيح ألواح الوسائط المخصبة ب 100 ميكرولتر من الوسائط المستهلكة بعد التقاط صورة DHM عن طريق نشرها باستخدام موزعة معقمة. ثم احتضنها في درجة الحرارة المناسبة لمدة 24 ساعة قبل عد المستعمرات.

يعد وجود تعداد دقيق للخلايا أمرا ضروريا لتحديد حدود الكشف كميا. من المهم إجراء جميع عمليات التخفيف بعناية فائقة باستخدام الماصات الدقيقة المعايرة وتأكيد جميع الأعداد بالكثافة الضوئية والطلاء والعد المباشر في حجرة Petroff-Hausser. لتحليل بيانات الوجود البكتيري في مقاطع الفيديو الهولوغرامية المكتسبة ، قم بإجراء تصفية مطروحة متوسطة عن طريق تحويل الصور أولا إلى تنسيق 32 بت.

ثم احسب متوسط قيمة البكسل. أخيرا ، اطرح هذه القيمة المتوسطة من كل بكسل معني للتخلص من القطع الأثرية الثابتة في الهولوغرام. بعد ذلك ، احسب عدد حلقات المنطقة المرئية والخلايا المحورية يدويا.

ستكون كل سلسلة من الصور المجسمة مصحوبة بملف طابع زمني. استخدم ملف الطابع الزمني لحساب الكمية الإجمالية للعينة التي تم ضخها في وقت التقاط الصورة. بعد ذلك ، احسب كثافة الخلية بقسمة العدد الإجمالي للخلايا المكتشفة على الحجم الإجمالي للعينة المصورة.

متوسط خمسة إلى 10 إطارات للحصول على إحصائيات دقيقة. يوضح هذا المخطط الخلايا المتوقعة لكل مجال رؤية بناء على حجم عينة يبلغ 365 ميكرومتر × 365 ميكرومتر × ملليمتر واحد. بالنسبة للتركيزات التي يقل فيها عدد الخلايا لكل مجال رؤية عن واحد ، يلزم وجود صور متعددة لتحقيق الكشف.

هذا هو تسلسل الهولوغرام DHM لثقافة Serratia marcescens عند 2 ، 100 خلية لكل مليلتر تقاس بعدد الألواح. يظهر التسلسل خلية واحدة تقريبا كل ثانية إلى ثانيتين وهو مناسب تماما للتنبؤ. وهذا تسلسل ثلاثي الأبعاد آخر ل DHM لثقافة Serratia marcescens عند 620 خلية لكل مليلتر تقاس بعدد الألواح.

يظهر هذا التسلسل خلية واحدة كل ست إلى سبع ثوان تقريبا. عند استخدام الفحص المجهري المجسم الرقمي لتصوير الخلايا ، تذكر استخدام تقنيات تعقيم المرشح في تحضير جميع الحلول. سيؤدي ذلك إلى تجنب إدخال الجسيمات في الأداة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحضير مزارع خلايا صحية وأن يكون لديك وسط نمو إضافي وألواح ووسط حركة في متناول اليد. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تلطيخ الفلورسنت من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل النسبة المئوية للخلايا الحية مقابل الميتة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف الحركة ثلاثية الأبعاد في الخلايا المستنبتة والعينات البيئية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تعداد البكتيريا باستخدام الفحص المجهري الثلاثي الأبعاد والتحقق من صحة النتائج باستخدام تقنيات العد الأخرى. لا تنس أن العمل مع الثقافات البكتيرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ احتياطات السلامة البيولوجية المناسبة عند زراعة الكائنات الحية والتعامل معها.