عالية الدقة مجهر ابيسكوبي (هريم) - بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة وتصور المواد العضوية
July 7th, 2017
نحن نقدم بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة المواد خزعة من مختلف الأنواع والأجنة من الكائنات الحية الحيوية نموذج والعينات من الأنسجة العضوية الأخرى من أجل السماح الرقمية توليد البيانات حجم مع عالية الدقة المنهج المجهري إبيسكوبيك.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء بيانات الحجم الرقمية للمواد العضوية. ومن الأمثلة على ذلك الأجنة والأنسجة الجنينية للكائنات الحية النموذجية الطبية الحيوية ، وكتل الأنسجة التي يتم حصادها من والبشر البالغين ، بما في ذلك خزعات الجلد أو العضلات والمواد مثل الورق غير المطلي وبدائل الجلد. يساعد HREM في الإجابة على الأسئلة الأساسية في مجالات الطب والبحوث الطبية الحيوية.
يسمح بالتحليل ثلاثي الأبعاد والتصور لأعضاء وأنسجة ، على سبيل المثال ، أجنة الفئران المعدلة وراثيا أو أجنة الكتاكيت التي تم التلاعب بها. كما يسمح بتحليل نماذج السرطان وكذلك الخزعات المأخوذة من الأنسجة البشرية أو الحيوانية. الميزة الرئيسية ل HREM هي أنه يوفر طريقة بسيطة لإنشاء أكوام من الصور ذات الجودة النسيجية القريبة.
يمتد تأثير هذه التقنية إلى البحث في التئام الجروح باستخدام النماذج الحيوانية ، بالإضافة إلى تدوير وإصلاح أمراض الأنسجة لدى البشر. سيظهر الإجراء BMR Marlene Rodler و Johannes Gunther. كلاهما من جامعة فيينا الطبية ، قسم التشريح.
ابدأ بأجنة ثابتة أو أنسجة جنينية لا يزيد حجمها عن 5 × 5 × 5 ملليلتر مكعب. قم بإزالة المثبت. وإضافة PBS.
يغسل على حرارة أربع درجات مئوية مع هزاز مستمر لمدة 24 ساعة. أضف 70٪ إيثانول إلى الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة وضع العينات على دوار عند أربع درجات مئوية. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات ، استمر في تجفيف العينات في محاليل الإيثانول ذات التركيز المتزايد لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في كل مرة.
أثناء تجفيف العينات ، قم بإعداد محلول التسلل عن طريق إضافة 0.3125 جرام من البنزويل بيروكسيد و 0.1 جرام من ESN إلى 25 مل من المحلول A في كوب. قلب على لوح تحريك مغناطيسي على أربع درجات مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات حتى يذوب ESN والمحفز تماما. ضع العينات في محلول التسلل.
وهز العينات أو تدويرها لمدة 12 إلى 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. ابدأ بإعداد محلول التضمين. أضف مليلتر واحد أو محلول B إلى 25 مل من محلول التسلل الجديد.
بعد تحضير صواني أكواب التشكيل ، املأ التجويف العميق للقوالب بمحلول التضمين. انقل العينات إلى القوالب باستخدام ملعقة. تأكد من تغطية العينة بالكامل بمحلول التضمين لتجنب حبس الهواء.
قم بتوجيه العينة داخل القالب باستخدام الإبر أو الملقط. من الأهمية بمكان تحسين اتجاه العينة أثناء التضمين وتحديد موضعها الدقيق على سطح الكتلة. بهذه الطريقة يمكن إبقاء منطقة الاهتمام صغيرة ويمكن استخدام الهدف بأعلى تكبير ممكن.
بمجرد أن يبدأ محلول التضمين في أن يصبح لزجا ، ضع حامل الكتلة أعلى القالب وأضف محلول التضمين من خلال الفتحة المركزية لحامل الكتلة حتى يرتفع محلول التضمين إلى ملليمتر إلى ملليمتر واحد فوق قاعدة حامل الكتلة. أغلق صينية أكواب التشكيل بتغطيتها بشمع البارافين السائل وانتظر حتى تتماسك قبل التحرك. اسمح للكتل بإنهاء البلمرة عن طريق تخزين صواني أكواب التشكيل محكمة الغلق لمدة يوم إلى يومين في درجة حرارة الغرفة.
لمعالجة ما بعد البلمرة ، ضع صواني أكواب التشكيل مع الكتل المبلمرة في فرن مختبر قياسي واخبزها على حرارة 70 إلى 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن يوم إلى يومين. قم بإزالة الكتل من القوالب. ثم حدد مجال الرؤية عن طريق توجيه الضوء الأبيض بشكل غير مباشر إلى سطح الكتلة.
تتبع الظل للعينة بالعلامة السوداء على سطح الكتلة. قم بتركيب كتلة الراتنج مع مجال الرؤية المشار إليه على الميكروتوم وتحريك حامل الكتلة إلى وضع توقفه. ابدأ تشغيل الكاميرا الرقمية وبرنامج توليد البيانات واحصل على صورة حية.
اختر هدفا مع التكبير المناسب لتغطية منطقة الاهتمام. حرك البصرية لأعلى ولأسفل والميكروتوم بشكل جانبي حتى تتطابق منطقة الاهتمام مع مجال الرؤية المعروض على شاشة الكمبيوتر. قسم الكتلة حتى تصبح الهياكل الأولى للعينة مرئية.
حرك الميكروتوم لترتيب سطح الكتلة في المستوى البؤري للبصرية. اختر سماكة القسم بين 0.5 إلى خمسة ميكرون. ثم بعد إعداد البرنامج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ابدأ البرنامج وابدأ في التقاط البيانات.
تظهر صورة قسم HREM هذه قسما سهميا من خلال جنين فأر تم حصاده في اليوم الجنيني 9.5. يظهر هذا النموذج ثلاثي الأبعاد المجلد سطح هذا الجنين. تظهر هذه الصورة قسما سهميا افتراضيا من خلال نموذج مجلد لعنق جنين الفأر الذي تم حصاده في اليوم الجنيني 15.5.
يسلط النموذج السطحي الضوء على لومينا نظام القلب والأوعية الدموية في عرض حجم لجميع أنسجة جنين الفرخ ، وهو همبرغر هاميلتون المرحلة 18 التنموية. تظهر هذه الصورة قسما من HREM من خلال عصب بشري. يعمل البطانة على تكبير قسم هذه الصورة.
تظهر هذه الصورة جزءا من صورة قسم HREM من خلال كبد الخنازير. تظهر هذه الصورة نموذجا ثلاثي الأبعاد معروض بحجم لخزعة مأخوذة من وسادة إبهام بشرية. تظهر هذه الصورة النماذج المعروضة على السطح للشرايين الجلدية والأوردة والأعصاب أمام استئصال افتراضي من خلال بيانات HREM.
تظهر هذه الرسوم المتحركة نموذجا مقدما بحجم الجلد السميك لوسادة الإبهام البشرية. عتبات مختلفة وبالتالي هياكل جلدية مختلفة ، مثل الأوعية الدموية والألياف العصبية والغدد العرقية وقنوات الغدد العرقية. يسمح HREM بالتصور السريع لبنية المواد الليفية.
تظهر هذه الصورة نموذجا مقدما بالحجم لمادة بديلة جلدية أصلية. تظهر هذه الرسوم المتحركة الحجم النموذج المعروض للمواد البديلة الجلدية. لاحظ الشكل المختلف وعيار الألياف.
يجب تجفيف العينات واختراقها وتضمينها في الراتنج بحيث يمكن أن يستغرق الإجراء بأكمله ما يصل إلى عدة أيام ولكنه يتضمن ساعتين إلى ثلاث ساعات فقط من الأعمال التشغيلية لإعداد الحلول وتغيير الحلول وما إلى ذلك. يتم تشغيل توليد البيانات نفسه مؤتمتة بالكامل على جهاز HREM ويمكن إنتاج 1000 صورة في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات. بعد تطويره ، مهد HREM الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء التنموي لتسجيل النمط الظاهري لأجنة الفئران الطافرة بدقة.
أحد الأمثلة على ذلك هو آليات فك تشفير اضطرابات النمو أو مشروع DMDD حيث يتم استخدام HREM في التنميط الظاهري ، أجنة الفئران المميتة جنينيا بتفاصيل غير معروفة حتى الآن. اتضح أن HREM هو أيضا بديل ممتاز للفحص المجهري الضوئي الموضعي لفحص الأوعية الدموية أو الأعصاب أو بنية الألياف في عينات الأنسجة البشرية.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولات لمعالجة مواد الخزعة والأنسجة العضوية لتوليد بيانات الحجم الرقمي باستخدام الفحص المجهري العلوي عالي الدقة (HREM). تسمح الطريقة بالتصور والتحليل ثلاثي الأبعاد للعينات البيولوجية المختلفة، بما في ذلك الأجنة والخزعات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- البحث الطبي الحيوي
- علم الأنسجة
- تقنيات الفحص المجهري
الخلفية
- يوفر HREM صورًا بجودة نسيجية تقريبًا.
- ينطبق على مواد عضوية مختلفة، بما في ذلك الأنسجة البشرية والحيوانية.
- تساعد التقنية في فهم الأسئلة الطبية الأساسية.
- تدعم البحث في مجالات مثل التئام الجروح ونماذج السرطان.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكولات قوية لمعالجة الأنسجة.
- تسهيل توليد بيانات حجم رقمي عالية الدقة.
- تعزيز التحليل ثلاثي الأبعاد للعينات البيولوجية.
الطرق المستخدمة
- إزالة الماء واختراق عينات الأنسجة.
- تضمين العينات في الراتينج للقطع.
- استخدام القاطع المجهري للقطع الدقيق.
- التقاط البيانات الآلي لإنشاء أكوام الصور.
النتائج الرئيسية
- الجيل الناجح لنماذج ثلاثية الأبعاد من أنواع أنسجة مختلفة.
- تصور هياكل معقدة مثل الأوعية الدموية والأعصاب.
- عرض التقنية على أنسجة الفئران والأنسجة البشرية.
- اكتساب الصور السريع مع مخرج عالي الجودة.
الاستنتاجات
- HREM هو أداة قيّمة للبحث الطبي الحيوي.
- البروتوكولات المنشأة بسيطة وفعالة.
- تعزز هذه الطريقة من فهم بنية الأنسجة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-resolution episcopic microscopy (HREM) enables biopharma R&D teams to generate near-histological quality 3D volume data from organic specimens, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The method provides predictive confidence in target validation by visualizing complex tissue architectures such as vasculature and innervation in disease-relevant models. This capability aids portfolio triage by reducing biological ambiguity in preclinical candidate selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through 3D visualization of organotypic structures in genetically modified embryos and human biopsies.
- Operational Value: Supports functional target validation by clarifying spatial relationships in tissue pathology models.
- Predictive Value: Enhances confidence in lead identification by phenotyping embryonic lethal models with subcellular detail.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, reproducible digital volume data enabling quantitative comparison across experimental conditions.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through automated image capture yielding 1000+ aligned sections in 2–3 hours.
- Scalability: Permits platform reuse across diverse organic materials including embryos, biopsies, and fibrous biomaterials.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by enabling virtual sectioning and 3D modeling of human tissue biopsies and animal disease models.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through visualization of structural phenotypes in wound healing and cancer models.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing high-fidelity architectural data for mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
HREM integrates into the discovery continuum from early biology through lead identification to preclinical validation by providing quantitative 3D readouts that support hypothesis testing and pathway analysis.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and biological de-risking via 3D phenotyping of mutant embryos and disease models.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible image stacks with near-histological quality for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative volumetric and surface-rendered outputs that allow teams to compare structural phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through 3D visualization of human biopsies and animal tissue architectures.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable across multiple organic specimen types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through high-resolution 3D visualization of tissue microstructure.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated data capture and inherent image alignment.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing late-stage biological risk through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization by delivering clear structural readouts for go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, tissue processing, and microscopy for optimal sample preparation and orientation.
- Dependent on microtome, digital video camera, and 3D visualization software infrastructure for data generation.
- Necessitates cross-team standardization in embedding orientation and region-of-interest marking for consistent results.
- Involves adaptation considerations across model systems due to variations in tissue size, density, and staining properties.
- Limited by specimen dimensions (up to 5x5x7 mm) and section thickness range (0.5–5 μm), which may constrain application to larger organs.
