عالية الدقة مجهر ابيسكوبي (هريم) - بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة وتصور المواد العضوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء بيانات الحجم الرقمية للمواد العضوية. ومن الأمثلة على ذلك الأجنة والأنسجة الجنينية للكائنات الحية النموذجية الطبية الحيوية ، وكتل الأنسجة التي يتم حصادها من والبشر البالغين ، بما في ذلك خزعات الجلد أو العضلات والمواد مثل الورق غير المطلي وبدائل الجلد. يساعد HREM في الإجابة على الأسئلة الأساسية في مجالات الطب والبحوث الطبية الحيوية.

يسمح بالتحليل ثلاثي الأبعاد والتصور لأعضاء وأنسجة ، على سبيل المثال ، أجنة الفئران المعدلة وراثيا أو أجنة الكتاكيت التي تم التلاعب بها. كما يسمح بتحليل نماذج السرطان وكذلك الخزعات المأخوذة من الأنسجة البشرية أو الحيوانية. الميزة الرئيسية ل HREM هي أنه يوفر طريقة بسيطة لإنشاء أكوام من الصور ذات الجودة النسيجية القريبة.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى البحث في التئام الجروح باستخدام النماذج الحيوانية ، بالإضافة إلى تدوير وإصلاح أمراض الأنسجة لدى البشر. سيظهر الإجراء BMR Marlene Rodler و Johannes Gunther. كلاهما من جامعة فيينا الطبية ، قسم التشريح.

ابدأ بأجنة ثابتة أو أنسجة جنينية لا يزيد حجمها عن 5 × 5 × 5 ملليلتر مكعب. قم بإزالة المثبت. وإضافة PBS.

يغسل على حرارة أربع درجات مئوية مع هزاز مستمر لمدة 24 ساعة. أضف 70٪ إيثانول إلى الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة وضع العينات على دوار عند أربع درجات مئوية. بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات ، استمر في تجفيف العينات في محاليل الإيثانول ذات التركيز المتزايد لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في كل مرة.

أثناء تجفيف العينات ، قم بإعداد محلول التسلل عن طريق إضافة 0.3125 جرام من البنزويل بيروكسيد و 0.1 جرام من ESN إلى 25 مل من المحلول A في كوب. قلب على لوح تحريك مغناطيسي على أربع درجات مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات حتى يذوب ESN والمحفز تماما. ضع العينات في محلول التسلل.

وهز العينات أو تدويرها لمدة 12 إلى 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. ابدأ بإعداد محلول التضمين. أضف مليلتر واحد أو محلول B إلى 25 مل من محلول التسلل الجديد.

بعد تحضير صواني أكواب التشكيل ، املأ التجويف العميق للقوالب بمحلول التضمين. انقل العينات إلى القوالب باستخدام ملعقة. تأكد من تغطية العينة بالكامل بمحلول التضمين لتجنب حبس الهواء.

قم بتوجيه العينة داخل القالب باستخدام الإبر أو الملقط. من الأهمية بمكان تحسين اتجاه العينة أثناء التضمين وتحديد موضعها الدقيق على سطح الكتلة. بهذه الطريقة يمكن إبقاء منطقة الاهتمام صغيرة ويمكن استخدام الهدف بأعلى تكبير ممكن.

بمجرد أن يبدأ محلول التضمين في أن يصبح لزجا ، ضع حامل الكتلة أعلى القالب وأضف محلول التضمين من خلال الفتحة المركزية لحامل الكتلة حتى يرتفع محلول التضمين إلى ملليمتر إلى ملليمتر واحد فوق قاعدة حامل الكتلة. أغلق صينية أكواب التشكيل بتغطيتها بشمع البارافين السائل وانتظر حتى تتماسك قبل التحرك. اسمح للكتل بإنهاء البلمرة عن طريق تخزين صواني أكواب التشكيل محكمة الغلق لمدة يوم إلى يومين في درجة حرارة الغرفة.

لمعالجة ما بعد البلمرة ، ضع صواني أكواب التشكيل مع الكتل المبلمرة في فرن مختبر قياسي واخبزها على حرارة 70 إلى 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن يوم إلى يومين. قم بإزالة الكتل من القوالب. ثم حدد مجال الرؤية عن طريق توجيه الضوء الأبيض بشكل غير مباشر إلى سطح الكتلة.

تتبع الظل للعينة بالعلامة السوداء على سطح الكتلة. قم بتركيب كتلة الراتنج مع مجال الرؤية المشار إليه على الميكروتوم وتحريك حامل الكتلة إلى وضع توقفه. ابدأ تشغيل الكاميرا الرقمية وبرنامج توليد البيانات واحصل على صورة حية.

اختر هدفا مع التكبير المناسب لتغطية منطقة الاهتمام. حرك البصرية لأعلى ولأسفل والميكروتوم بشكل جانبي حتى تتطابق منطقة الاهتمام مع مجال الرؤية المعروض على شاشة الكمبيوتر. قسم الكتلة حتى تصبح الهياكل الأولى للعينة مرئية.

حرك الميكروتوم لترتيب سطح الكتلة في المستوى البؤري للبصرية. اختر سماكة القسم بين 0.5 إلى خمسة ميكرون. ثم بعد إعداد البرنامج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ابدأ البرنامج وابدأ في التقاط البيانات.

تظهر صورة قسم HREM هذه قسما سهميا من خلال جنين فأر تم حصاده في اليوم الجنيني 9.5. يظهر هذا النموذج ثلاثي الأبعاد المجلد سطح هذا الجنين. تظهر هذه الصورة قسما سهميا افتراضيا من خلال نموذج مجلد لعنق جنين الفأر الذي تم حصاده في اليوم الجنيني 15.5.

يسلط النموذج السطحي الضوء على لومينا نظام القلب والأوعية الدموية في عرض حجم لجميع أنسجة جنين الفرخ ، وهو همبرغر هاميلتون المرحلة 18 التنموية. تظهر هذه الصورة قسما من HREM من خلال عصب بشري. يعمل البطانة على تكبير قسم هذه الصورة.

تظهر هذه الصورة جزءا من صورة قسم HREM من خلال كبد الخنازير. تظهر هذه الصورة نموذجا ثلاثي الأبعاد معروض بحجم لخزعة مأخوذة من وسادة إبهام بشرية. تظهر هذه الصورة النماذج المعروضة على السطح للشرايين الجلدية والأوردة والأعصاب أمام استئصال افتراضي من خلال بيانات HREM.

تظهر هذه الرسوم المتحركة نموذجا مقدما بحجم الجلد السميك لوسادة الإبهام البشرية. عتبات مختلفة وبالتالي هياكل جلدية مختلفة ، مثل الأوعية الدموية والألياف العصبية والغدد العرقية وقنوات الغدد العرقية. يسمح HREM بالتصور السريع لبنية المواد الليفية.

تظهر هذه الصورة نموذجا مقدما بالحجم لمادة بديلة جلدية أصلية. تظهر هذه الرسوم المتحركة الحجم النموذج المعروض للمواد البديلة الجلدية. لاحظ الشكل المختلف وعيار الألياف.

يجب تجفيف العينات واختراقها وتضمينها في الراتنج بحيث يمكن أن يستغرق الإجراء بأكمله ما يصل إلى عدة أيام ولكنه يتضمن ساعتين إلى ثلاث ساعات فقط من الأعمال التشغيلية لإعداد الحلول وتغيير الحلول وما إلى ذلك. يتم تشغيل توليد البيانات نفسه مؤتمتة بالكامل على جهاز HREM ويمكن إنتاج 1000 صورة في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات. بعد تطويره ، مهد HREM الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء التنموي لتسجيل النمط الظاهري لأجنة الفئران الطافرة بدقة.

أحد الأمثلة على ذلك هو آليات فك تشفير اضطرابات النمو أو مشروع DMDD حيث يتم استخدام HREM في التنميط الظاهري ، أجنة الفئران المميتة جنينيا بتفاصيل غير معروفة حتى الآن. اتضح أن HREM هو أيضا بديل ممتاز للفحص المجهري الضوئي الموضعي لفحص الأوعية الدموية أو الأعصاب أو بنية الألياف في عينات الأنسجة البشرية.