تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة

الهدف العام من سير العمل هذا هو تحديد أهداف معينة للتصوير فوق البني داخل الأنسجة باستخدام الفحص المجهري الضوئي متبوعا بالتصوير ثلاثي الأبعاد في SEM بدقة عالية جدا. يمكن أن يساعد سير عمل التصوير المقدم هنا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول البنية الفوقية للخلايا أو الأنسجة في عدد من المجالات ، مثل بيولوجيا الخلية أو علم الأحياء التنموي أو علم الأعصاب أو حتى علم الأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية ، التي تعتمد في الواقع على التصوير المقطعي المصفوفة ، هي أن تقطيع الأنسجة إلى مصفوفات من المقاطع التسلسلية يجعل من السهل تحديد الهياكل المستهدفة ، حتى عندما يتم دفنها في البداية داخل حجم العينة الأصلي.

تم تقديم التصوير المقطعي المصفوفة في الأصل في سياق علم الأعصاب ، ولكن يمكن أيضا تطبيقه على مجموعة واسعة من الأنظمة الأخرى ، بما في ذلك البكتيريا والنباتات وحتى عينات المرضى في بيئة علم الأمراض. سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن جمع العديد من الأقسام التسلسلية أمر صعب للغاية. قد يتسبب العمل بدون دعم إضافي في فقدان الأقسام أو عدم ترتيب الشرائط.

باستخدام فرشاة صغيرة مكونة من عدد قليل من الشعيرات المثبتة على عود أسنان ، قم بتغطية الجوانب الأمامية والخلفية للكتلة المشذبة مسبقا بمزيج لاصق. قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة لأن مذيب هذا الخليط يتبخر في غضون ثوان. أثناء جفاف العينات ، قم بتقطيع قطع رقائق السيليكون إلى حجم يناسب قارب السكين وقم بتمييزها باستخدام كاتب الماس.

بعد ذلك ، قم بتنظيف رقاقة السيليكون يدويا باستخدام الأيزوبروبانول والمناديل الخالية من النسالة. قم بتثبيت الركيزة على أحد طرفي اللوحة الحاملة باستخدام مادة لاصقة قابلة للإزالة. بمجرد ضبطها ، تقوم البلازما بتنشيط الركيزة باستخدام تفريغ التوهج بالهواء للحصول على سطح محب للماء.

مع اقتراب الركيزة المركبة من حافة السكين ، أدخل الحامل في مشبك حامل الركيزة. بعد ذلك ، أدخل سكينا ماسيا جامبو في حامل السكين واضبط زاوية الخلوص على صفر درجة. ثم املأ قارب السكين بالماء المقطر.

اقترب من السكين بحيث يكون من ملليمتر إلى ملليمترين من العينة. بعد ذلك ، قم بخفض الركيزة في الماء باستخدام مسامير من واحد إلى ثلاثة من حامل الركيزة. تأكد من أن خط المياه يقع في الثلث العلوي من الركيزة.

نظرا لأنه من الصعب رؤية الخلوص الأرضي عند استخدام رقاقة السيليكون ، اخفض الركيزة حتى تشعر أنها تلامس الأرض. ثم ارفع الركيزة بكمية صغيرة. تأكد من عدم لمس الركيزة ولا الناقل قارب السكين أثناء القطع.

بعد ذلك ، استخدم حقنة أو ماصة لضبط مستوى الماء في القارب. أثناء المشاهدة من خلال المجهر ، أضف الماء أو أزله حتى تظهر المساحة الكاملة لسطح الماء انعكاسا متجانسا لإضاءة الضوء العلوي للميكروتوم. بمجرد اكتمال الإعداد، ابدأ في تقسيم العينة.

عند قطع عدد من الأقسام ، أوقف عملية التقسيم وحرر الشريط من حافة السكين عن طريق التمسيد برفق على حافة السكين برموش أو شعر قطة ناعم جدا. قم بمعالجة الشريط باتجاه الركيزة وادفع القسم الأول من الشريط برفق لإرفاقه بالجزء الجاف من الركيزة. استمر في تقسيم العينة وربط الأشرطة بالركيزة.

ابدأ من جانب واحد من الركيزة وتحرك تدريجيا نحو الآخر مع كل شريط جديد. عندما تكون الركيزة مغطاة بالكامل بشرائط ، ارفع الركيزة برفق من قارب السكين باستخدام مسامير المعالجة الدقيقة لحامل الركيزة. دع مجموعة الشريط تجف ثم قم بتخزينها في بيئة خالية من الغبار.

بعد التجفيف ، قم بإزالة الركيزة المثبتة على المواد اللاصقة في أسرع وقت ممكن من الناقل. بعد ذلك ، قم بتلطيخ عينتك للفحص المجهري الضوئي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب وقم بإجراء التصوير. بعد ذلك ، قم بتلطيخ العينة للفحص المجهري الإلكتروني وقم بتثبيتها على بذرة من الألومنيوم باستخدام وسادة كربون لزجة.

الآن قم بتصوير هذه المصفوفات في المجهر الإلكتروني الماسح للانبعاث في المجال. لتجنب الشحن ، استخدم طاقات الإلكترون الأولية التي تبلغ ثلاثة كيلو فولت أو أقل وتيار شعاع بين 50 و 800 بيكوأمبير. عند استخدام زلات الغطاء الزجاجي المطلي ب ITO ، قم بتوصيل السطح الموصل بحامل المجهر بشريط نحاسي وطلاء فضي.

تتمثل الخطوة الأولى في سلسلة التصوير الهرمي في إنشاء نظرة عامة على المصفوفة بطريقة يمكن من خلالها التعرف على الأقسام الفردية. حدد أولا الزوايا الأربع للمصفوفة الخاصة بك عن طريق رسم صورة لكل زاوية بتكبير منخفض ، حوالي 100x ، ثم قم بإنشاء عائد استثمار يحيط بالمصفوفة بأكملها. قم بتعيين بروتوكول تصوير لعائد الاستثمار هذا باستخدام المعلمات التالية.

استخدم كاشف الإلكترون الثانوي للتصوير عالي السرعة باستخدام وقت سكون قصير يبلغ حوالي 0.2 ميكروثانية. اختر حجم بكسل صورة كبير وحجم بلاط 2000 × 2000 بكسل. والنتيجة هي صورة صاخبة للغاية ولكن حتى هنا ، تكون الأنسجة داخل القسم مرئية.

بعد ذلك ، قم بإنشاء مجموعة أقسام عن طريق إنشاء منطقة اهتمام ، تحدد فقط الأنسجة في القسم الأول. قم باستنساخها إلى جميع الأقسام اللاحقة باستخدام أداة الطوابع. قم بتدوير مناطق الاهتمام عند الحاجة لاستيعاب الأشرطة المنحنية.

قم بتعيين بروتوكول للقسم الذي يعرض البنية التحتية للأنسجة بشكل أفضل. هنا ، تم استخدام حجم بكسل متوسط يبلغ 60 نانومتر ، وحجم بلاط 12000 × 12000 بكسل ، ووقت سكون يبلغ 3.2 ميكروثانية. نظرا للجودة الرديئة ، تم إنشاء مجموعة قسم ثان تحدد عددا قليلا من الخلايا باستخدام حجم بكسل أصغر وكاشف أكثر حساسية.

الآن من الممكن التعرف على الخليتين المستهدفتين جيدا. قم بإنشاء مجموعة مواقع ضمن مجموعة الأقسام التي تحتوي على البنية المستهدفة لتصوير التسويق عبر محرك البحث عالي الدقة. اجعل منطقة الاهتمام كبيرة بما يكفي لحساب الدقة المرحلية.

تحقق من مواقع المواقع واضبطها. يعد الضبط التلقائي ضروريا عند تصوير العديد من الأقسام. من المهم وضع مناطق الاهتمام بحيث لا يجلس المركز على مواد فارغة بدون تفاصيل هيكلية ، على سبيل المثال ، الفجوات.

بعد ذلك، حدد إعدادات التركيز البؤري التلقائي وتحقق من أداء التصوير على طول الشريط في منطقة صغيرة من الاهتمام قريبة من الموقع الذي سيتم تصويره. بعد ذلك ، حدد بروتوكول تصوير للحصول على SEM عالي الدقة. لرؤية مقصورات الغشاء ، اختر حجم بكسل الصورة بين ثلاثة وخمسة نانومتر.

حدد وقت المكوث اعتمادا على الكاشف حتى لا تكون الصورة صاخبة جدا. نظرا لأن المرحلة يجب أن تقطع مسافة كبيرة بين تسجيل هذا القسم وهذا القسم، قم بتحديد قيم التركيز على القسم الأول على الأقل من كل شريط باستخدام خيار بروتوكول التحقق. ثم ابدأ التصوير الآلي لعملية التسويق عبر محرك البحث عبر سلسلة كاملة من المناطق المستهدفة ذات الاهتمام.

عند الانتهاء ، قم بتصدير البيانات المكتسبة كسلسلة صور ، ويفضل أن يكون ذلك بتنسيق TIF. استيراد سلسلة الصور إلى فيجي كمكدس افتراضي. بعد ذلك ، قم بقص المكدس لمزيد من المعالجة عن طريق تقليم المنطقة في أقرب وقت ممكن من الهيكل محل الاهتمام.

أيضا ، اضبط السطوع والتباين واحفظ المكدس. بمجرد اقتصاصه وتحسينه ، افتح TrakEM جديدا من قائمة ملف. انقر بزر الماوس الأيمن في حقل الصورة واستورد المكدس إلى TrakEM كشريحة واحدة لكل طبقة.

بالنقر بزر الماوس الأيمن، اختر محاذاة الطبقات. اختر المربعات الصغرى كوضع ، واضبط النطاق من الأول إلى الأخير ، واختر لا شيء كمرجع. بعد ذلك ، حدد قيم الإعداد الافتراضية واختر Rigid كتحويل مطلوب.

عند اكتمال التسجيل ومرضيا، احفظ مجموعة البيانات المحاذاة بالنقر بزر الماوس الأيمن واختيار تصدير. قم بعمل صورة مسطحة ، واضبط النطاق من الصورة الأولى إلى الأخيرة ، ودع البرنامج يعرض المكدس الناتج. عند الانتهاء، احفظ المكدس بتنسيق TIF.

بعد التحضير ، تظهر مصفوفة الأقسام كمصفوفة تتكون من عدة شرائط من الأقسام التسلسلية. يوضح هذا القسم نظرة عامة على طرف جذر الأرابيدوبسيس الملطخ بيوديد البروبيديوم. تمت محاذاة الأقسام المتسلسلة من هذه العينة كما هو موضح في البروتوكول ودمجها لإظهار العينة في 3D كملف فيلم واحد.

هنا ، يمكن للمرء أن يرى الخليتين المستهدفتين اللتين سيتم تصويرهما لاحقا بدقة نانومتر في SEM. بعد تلطيخ إضافي بخلات اليورانيل وسيترات الدم ، تم تصوير المصفوفات في المجهر الإلكتروني. تظهر هذه الصورة الثابتة قسم العينة الذي تم تصويره لأول مرة بدقة 20 نانومتر وفي جولة التصوير الثانية بدقة خمسة نانومتر.

هنا ، تمت محاذاة 210 صورة متسلسلة من المجهر الإلكتروني واقتصاصها كما هو موضح في البروتوكول. يستهدف الفيديو خليتين فقط ويوضح كيف يتم ترتيب الفجوات داخل الخلايا وتوصيلها أحيانا في 3D. يمكن أن يوفر التصوير الهرمي الآلي للمصفوفات في SEM الموضح هنا تخطيطا سلسا بمستويات دقة مختلفة ، من نظرة عامة على المصفوفة بأكملها إلى التفاصيل تحت الخلوية.

في أعلى تكبير ، يمكن التعرف على الفجوات والميتوكوندريا والنواة والشبكة الإندوبلازمية. بمجرد إتقانها ، يمكن وضع شرائط القسم جنبا إلى جنب على ركيزة نموذجية في غضون ساعات قليلة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. قد يوفر هذا مئات الأقسام على ركيزة واحدة للتصوير.

يمكن أن يختلف وقت التصوير لمثل هذه الأعداد الكبيرة من الأقسام من مجهر إلى آخر ، وأكثر من ذلك إذا كانت أدوات التصوير المفضلة لديك تحتوي على مستويات مختلفة من الأتمتة. من المثير للاهتمام ملاحظة أنه يمكن بسهولة دمج سير العمل العام مع تقنيات التصوير الأخرى ، مثل تلطيخ الأنسجة القياسية أو حتى تلألؤ الشمعة ، أو يمكن استخدامه ببساطة كأداة قائمة بذاتها للتصوير الهيكلي للخلايا الكبيرة. جانب آخر من سير العمل هذا هو سهولة الوصول.

الدراسات الأولية ممكنة بدون أدوات إضافية أو أتمتة ، مما يعني بدون استثمار كبير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن سير العمل وكيف يمكن استخدام التصوير متعدد الوسائط وكذلك التصوير الهرمي لاستهداف وتصوير الهياكل المثيرة للاهتمام في حجم كبير ثلاثي الأبعاد بمستويات مختلفة من الدقة.