أسلوب أوبتوجينيتيك لمراقبة وتحليل أنماط التعبير الجيني في تفاعلات الخلية للخلية
March 22nd, 2018
نقدم هنا، بروتوكول تحليل خلية إلى نقل المعلومات متذبذبة بالتحكم أوبتوجينيتيك والعيش الرصد للتعبير الجيني. هذا النهج يوفر منبرا فريداً لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.
الهدف العام من هذه التجربة هو مراقبة نقل المعلومات التذبذبية من خلية إلى أخرى عن طريق التحكم البصري الوراثي والمراقبة الحية للتعبير الجيني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية تواصل الخلايا مع بعضها البعض من خلال مسار إشارات Notch ، لا سيما حول كيفية نقل الخلايا للمعلومات التذبذبية إلى بعضها البعض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا التحكم في ديناميكيات التعبير الجيني ومراقبتها بدقة عالية جدا.
سيوضح هذا الإجراء أكيهيرو إيسومورا ، زميل باحث من مختبري طور هذه التكنولوجيا الجديدة. لنقل نواقل البلازميد للوحدات البصرية الوراثية القائمة على Tol2 جنبا إلى جنب مع ناقل تعبير الينقولاز إلى خلايا C2C12 ، قم أولا بحساب الخلايا المطبقة على التربسين باستخدام عداد الخلايا. اللوحة 50 ، 000 خلية C2C12 لكل بئر في صفيحة مكونة من 12 بئرا قبل يوم واحد من التعداد.
بعد ذلك ، قم بنقل 0.375 ميكروغرام من نواقل البصر الوراثية القائمة على Tol2 ، و 0.125 ميكروغرام من ناقل اختيار الدواء ، و 0.5 ميكروغرام من ناقل تعبير الينقولاز باستخدام كاشف شفط الدهون. قم بتربسين الخلايا المنقولة ، ووضعها في أطباق مزرعة 100 ملم بعد يوم واحد من التعدين. استبدل وسط الاستزراع للخلايا المنقولة إلى وسط مزرعة مكمل ب 100 ملليغرام لكل مليلتر هيغروميسين.
استزرع الخلايا لمدة ثلاثة أيام للقضاء على الخلايا غير المنقولة. لاحظ أن التغيير المتوسط ليس ضروريا. بعد ذلك ، قم بتربسين الخلايا المنقولة ، وتنقية مجموعة من الخلايا التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت للاختيار عن طريق فرز جهاز الاستقبال والخلايا الحساسة للضوء ، كما هو مفصل في بروتوكول النص.
قم بإعداد نوعين من الحاضنات مع أو بدون مصادر ضوء لحالة ناتجة عن الضوء أو حالة مظلمة. استخدم مقياس الضوء لإعداد شدة الضوء لمصباح إضاءة LED أزرق. قم بقياس شدة الضوء بعد إغلاق الباب.
توقيتات البرنامج ومدة إضاءة الضوء عن طريق تحميل برنامج نصي للتحكم على متحكم أحادي اللوحة يسمح بجداول زمنية قابلة للبرمجة للإضاءة. عد الخلايا المثقبدة باستخدام عداد الخلايا ، ولوحة 100،000 خلية مرسل حساسة للضوء تحمل pAI218 و pAI170 على أطباق استزراع بلاستيكية قطرها 35 ملم. ضع الأطباق في حاضنات منفصلة للظروف المظلمة والخفيفة.
بعد إعداد الأطباق ، احتفظ بأبواب الحاضنات مغلقة حتى جمع محللات الخلية. بعد يوم ونصف من الطلاء ، ابدأ إضاءة الضوء. لا تعرض الخلايا لضوء غير منضبط لتجنب التحفيز الضوئي غير المرغوب فيه.
لذا ، قم بهذه الخطوة دون فتح الباب. لاحظ أن فتح الباب هنا هو فقط للتوضيح. بعد حوالي يومين من الطلاء ، انقل أطباق العينات من الحاضنات إلى الثلج على فترات مدتها 30 دقيقة ، وابدأ في تحضير محللات الخلايا لمزيد من التحليل.
لمراقبة الاستجابات الخلوية عند التحفيز البصري بواسطة PMT في الوقت الفعلي ، قم أولا بعمل التربسين وحساب عدد خلايا المرسل والمستقبل بالطرق القياسية. قم بإعداد تعليق الحجم الكلي سعة ملليلتر واحد من 25،000 جهاز استقبال و 125،000 خلية مرسل. ضع الخلايا المختلطة في كل بئر من 24 بئرا من ألواح سوداء مع وسط استزراع يحتوي على لوسيفيرين واحد ملليمول.
قم بتحليل الخلايا الموجودة على قارئ اللوحة لمقايسة لوسيفيراز للتأكد من أن إشارات الإخراج ليست عالية جدا بالنسبة لنظام التسجيل. بعد ذلك ، اضبط اللوحة على نظام التسجيل ، وابدأ برنامج تسجيل. على سبيل المثال ، ابدأ إضاءة الضوء بعد 18 ساعة من ضبط التسجيل.
للتصوير في الوقت الفعلي لاستجابات الخلية المفردة تحت سيطرة الاضطراب البصري الوراثي ، اللوحة الأولى 50 ، 000 جهاز استقبال و 250 ، 000 خلية مرسل على أطباق بقطر 27 ملم بقطر 35 ملم. تأكد من ضبط نسب الخلط والعدد الإجمالي للخلايا بشكل صحيح. بعد يوم واحد من الطلاء ، استبدل الوسط بملليلترين من وسط التسجيل.
ضع الطبق ذو القاعدة الزجاجية على مجهر مقلوب مزود بغرفة بيئية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإعداد كاميرا CCD مبردة. تأكد من تبريد درجة حرارة مستشعر CCD إلى قيمة الوجهة.
قم بتعيين معلمات لنافذة الفاصل الزمني متعددة الأبعاد في برنامج الاستحواذ التلقائي لالتقاط الصور بفواصل زمنية مدتها خمس دقائق وأكثر من 288 مرة. في نافذة اللقطات المتتابعة متعددة الأبعاد، حدد قناة لمعان. تأكد من ضبط وضع القراءة على وضع القراءة البطيء البالغ 50 كيلو هرتز ، وهو أمر بالغ الأهمية لتقليل ضوضاء القراءة للكشف عن الضوء الحيوي الضعيف
.في نافذة اللقطات المتتابعة متعددة الأبعاد، حدد قنوات الفلورة. تأكد من ضبط وضع القراءة على وضع الميجاهرتز السريع لتقليل الوقت اللازم للتصوير الفلوري. أخيرا ، قم بتعيين binning اثنين في اثنين مع تعريض 400 مللي ثانية.
بعد ذلك ، حدد علامة تبويب دفتر اليومية لإعداد جداول زمنية لتحفيز الخلايا بإضاءة دورية للضوء الأزرق. انقر فوق زر علامة الجمع لإضافة إعداد دفتر يومية جديد. حدد ملف دفتر يومية من مربع دفتر اليومية، واختر نقاط زمنية متعددة، وقم بتعيين القيم في مربعات النقاط الأولية والفاصل الزمني لجدولة التحفيز.
تأكد من أن ملف دفتر اليومية المحدد يتضمن بروتوكولات متسلسلة لتحديد الإضاءة وفتح الغالق والتأخير وإغلاق الغالق والتأخير. بعد ذلك ، قم بإعداد جداول زمنية لتحفيز الخلايا بإضاءة دورية للضوء الأزرق. أخيرا ، ابدأ التسجيل بفاصل زمني بالنقر فوق الحصول على زر.
أخيرا ، استخرج آثار أحادية الخلية لقنوات التلألؤ من أفلام اللقطات المتتابعة ، كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر هنا النتائج التمثيلية لمقايسات المرسل والمستقبل البصري. أنتجت الخلايا المرسلة المحفزة للصور أنماطا تذبذبية لتعبير دلتا ليجند في وجود إضاءة دورية للضوء الأزرق ، كما هو متوقع.
عندما يتم زراعة خلايا المستقبل بشكل مشترك مع الخلايا المرسلة الحساسة للضوء وتعريضها لإضاءة الضوء المتكررة ، يكتشف نظام تسجيل التلألؤ الحيوي في الوقت الفعلي الاستجابات الدورية لخلايا الاستقبال في ظروف مختلفة من نسب الخلط. علاوة على ذلك ، يكشف الفحص المجهري بفاصل زمني مع إضاءة الضوء المتكررة أيضا عن الاستجابات المتزامنة لخلايا الاستقبال على مستوى الخلية الواحدة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف كيفية نقل المعلومات الديناميكية للتعبير الجيني في تفاعلات الخلية الخلية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتحليل نقل المعلومات المتذبذبة بين الخلايا باستخدام التحكم البصري الوراثي والمراقبة الحية للتعبير الجيني. تتيح الطريقة التحكم الدقيق والمراقبة لديناميات التعبير الجيني، مما يوفر رؤى حول التواصل الخلوي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- التحكم البصري الوراثي
الخلفية
- فهم التواصل بين الخلايا أمر بالغ الأهمية لفك شفرة الأنظمة متعددة الخلايا.
- يلعب مسار إشارات Notch دورًا مهمًا في التفاعلات الخلوية.
- نقل المعلومات المتذبذبة هو جانب أساسي من الديناميات الخلوية.
- تتيح الأدوات البصرية الوراثية التلاعب الدقيق في التعبير الجيني.
هدف الدراسة
- لمراقبة كيفية تواصل الخلايا من خلال إشارات متذبذبة.
- للتحقيق في ديناميات التعبير الجيني في سياق متعدد الخلايا.
- لتطوير منصة لاختبار الأهمية الوظيفية لبرامج التعبير الجيني.
الطرق المستخدمة
- نقل نواقل البلازميد إلى خلايا C2C12.
- استخدام وحدات التحكم البصري الوراثي المستندة إلى Tol2.
- المراقبة الحية لديناميات التعبير الجيني.
- تقنيات حساب الخلايا وزرعها للنقل.
النتائج الرئيسية
- نقل ناجح للوحدات البصرية الوراثية إلى الخلايا المستهدفة.
- تبرهن على نقل المعلومات المتذبذبة بين الخلايا.
- دقة عالية في التحكم في ديناميات التعبير الجيني.
- رؤى حول دور مسار إشارات Notch في التواصل الخلوي.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيّمة لدراسة التواصل بين الخلايا.
- يعزز التحكم البصري الوراثي فهمنا لديناميات التعبير الجيني.
- قد تكون للنتائج آثار في فهم الأنظمة متعددة الخلايا.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This optogenetic method enables precise temporal control and live monitoring of gene expression in cell-to-cell interactions, addressing a key challenge in deciphering dynamic signaling mechanisms. By revealing how oscillatory Notch signaling entrains intrinsic cellular rhythms through frequency tuning and phase shifting, the approach provides mechanistic de-risking for target validation in multicellular systems. It supports predictive confidence in early discovery by linking dynamic gene expression programs to functional intercellular communication.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing how periodic inputs of signaling pathways entrain intrinsic oscillations at single-cell resolution.
- Operational Value: Enables functional target validation through optogenetic perturbation and real-time readout of gene expression dynamics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying how dynamic signaling features influence cellular response patterns in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated sender-receiver coculture systems for downstream screening of modulators affecting oscillatory signal transfer.
- Operational Value: Standardizes light-controlled stimulation protocols and luminescent readouts for reproducible, quantitative assay outputs.
- Scalability: Facilitates platform reuse across signaling pathways by decoupling optogenetic control from specific genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects dynamic gene expression measurements in vitro to potential biomarker alignment in multicellular disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed oscillatory patterns are drivers or passengers in pathogenic signaling, reducing ambiguity in target selection.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating whether modulating signal dynamics alters phenotypic outcomes in receiver cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to assay readiness for lead identification, particularly when dynamic signaling behavior is a key determinant of target validity.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of how oscillatory information transfer contributes to cellular decision-making in Notch and similar pathways.
- Screening: Enables assay development for compounds that disrupt or enhance frequency-specific signal transmission between cells.
- Analytics: Provides quantitative time-series data on luminescence and fluorescence readouts, enabling statistical comparison of entrainment efficacy across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies when oscillatory dynamics correlate with functional states in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular optogenetic platform applicable to multiple signaling systems beyond Notch, increasing long-term ROI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by resolving mechanistic ambiguity in how dynamic gene expression programs influence intercellular communication.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible control over temporal stimulation and real-time monitoring, reducing variability in complex coculture systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of whether targeting dynamic signaling features yields measurable phenotypic effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets where signal dynamics, not just static expression, are functionally relevant.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, live-cell imaging, and luciferase-based reporter systems.
- Depends on access to programmable light sources, environmental chambers, and plate readers capable of low-light luminescence detection.
- Necessitates standardization of light intensity, timing schedules, and cell mixing ratios across teams for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the system to primary cells or in vivo models due to differences in transfection efficiency and light penetration.
- Practical limitations include potential phototoxicity from prolonged blue-light exposure and signal saturation in high-density cocultures, as noted in the protocol’s optimization steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Generation of Stable Cell Lines by the Tol2 System
2:07
Evaluation of Photo-sensitivity of Engineered Cells at the Population Level
3:31
Dynamic Sender-receiver Assay at the Population Level and at the Single-cell Level
6:47
Results: Analysis of Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions
7:35
Conclusion
