طريقة بسيطة لعزل بروتوبلاستس فول الصويا وتطبيق لتحليل التعبير الجيني عابر

قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وفعالة لإعداد كميات كبيرة من فول الصويا بروتوبلاستس لدراسة آليات تنظيمية والإشارات المعقدة في الخلايا الحية.

الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على خلايا البروتوبلاست عالية الجودة من فول الصويا لفحص الآليات التنظيمية والإشارات في خلايا فول الصويا الحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الشبكات التنظيمية مثل ماهية الجين المستهدف المباشر ، وفتح عامل نقل الدم ، وما هو شريكهم المتفاعل ، فتح البروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الفن.

ينتج كميات كبيرة من خلايا بروتولاست فول الصويا الموحدة ، وهو بسيط وسهل. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه من الصعب جدا الحصول على البروتوبلاست اللطيف من أوراق فول الصويا ما لم تقم بتقطيع أحادية الورق في مرحلة معينة. يعد اختيار الأوراق في مرحلة النمو المناسبة هو مفتاح التحضير الناجح لبروتوبلاست فول الصويا.

قطع الأوراق أحادية الورقة الموسعة حديثا من شتلات فول الصويا التي يبلغ عمرها 10 أيام. للتأكد من أنه عندما تعطي العينة عائدا مرتفعا من البروتوبلاست ، اجمع ثلاث عينات على الأقل من الأوراق أحادية الأوراق في مراحل نمو مختلفة قليلا. باستخدام شفرة حلاقة جديدة ، قم بإزالة الوسط من كل ورقة أحادية الأوراق ، ثم قم بتقطيع البقايا إلى شرائح من 0.5 إلى ملليمتر واحد.

باستخدام زوج من الملقط ، انقل شرائح الأوراق برفق على الفور إلى 10 مل من محلول الإنزيم الطازج في أنبوب سعة 15 مل. تسلل إلى شرائح الأوراق بالمكنسة الكهربائية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احتضان شرائط الأوراق في محلول الإنزيم بتحريض لطيف تحت الإضاءة المنخفضة لمدة أربع إلى ست ساعات في درجة حرارة الغرفة.

عندما يتم إطلاق البروتوبلاست ، سيتحول محلول الإنزيم إلى اللون الأصفر والأخضر. افحص محلول إنزيم البروتوبلاست تحت المجهر بتكبير 10x لتحديد العينة ذات أفضل هضم للبروتوبلاست. البروتوبلاست الذي تم إطلاقه كروي الشكل ، في حين أن الخلايا غير المهضومة لها أشكال غير منتظمة أو بيضاوية.

لوقف الهضم ، اسكب برفق 10 مل من محلول إنزيم البروتوبلاست مع أفضل هضم للبروتوبلاست في أنبوب سعة 50 مليلتر ، وأضف 10 مل من محلول W5 في درجة حرارة الغرفة. اقلب الأنبوب برفق عدة مرات. بعد ذلك ، اسكب محلول إنزيم البروتوبلاست برفق في شبكة نايلون نظيفة سعة 75 ميكرون موضوعة فوق أنبوب سعة 50 مليلتر لإزالة أنسجة الأوراق غير المهضومة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتدفق عبر محلول إنزيم البروتوبلاست عند 100 مرة G لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لإزالة المادة الطافية برفق دون إزعاج حبيبات البروتوبلاست. أعد تعليق البروتوبلاست في محلول W5 المبرد ، واحتفظ بأنبوب 50 مليلتر على الثلج.

بعد عد رقم البروتوبلاست على مقياس الدم تحت المجهر ، خفف إلى تركيز مرتين في 10 إلى البروتوبلاست الخامس لكل مليلتر في محلول W5 المبرد. احتفظ بالبروتوبلاست على الجليد لمدة 30 دقيقة. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 100 مرة G لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

ثم استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لإزالة محلول W5 برفق دون إزعاج حبيبات البروتوبلاست. أعد تعليق البروتوبلاست في محلول MMG في درجة حرارة الغرفة بتركيز اثنين في 10 إلى البروتوبلاست الخامس لكل مليلتر. لتحضير البروتوبلاست للتحويل، استخدم أطراف ماصة غير مقطوعة سعة 200 ميكرولتر لعمل 100 ميكرولتر من البروتوبلاست في أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة الالتصاق سعة 1.5 ملليلتر.

ضع جانبا حصة واحدة لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي. إلى الكمية المتبقية من البروتوبلاست ، أضف 10 ميكرولترات من الحمض النووي البلازميد. أضف ببطء 110 ميكرولتر من محلول الوتد المحضر حديثا على الجدار الداخلي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.

ثم اقلب الأنبوب برفق وقم بتدويره حتى يصبح المحلول متجانسا. احتضان مخاليط التحويل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لإيقاف التحول ، أضف ببطء 400 ميكرولتر من محلول W5 إلى كل أنبوب سعة 1.5 مليلتر في درجة حرارة الغرفة ، وقم بقلب الأنبوب برفق حتى يصبح المحلول متجانسا.

الطرد المركزي للأنابيب عند 100 مرة G لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية. أضف ملليلتر واحد من محلول WI لكل أنبوب.

قم بتغطية سطح البئر للوحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار لمنع البروتوبلاست من الالتصاق باللوحة. أضف ملليلترا واحدا من مصل العجل المعقم بنسبة خمسة بالمائة إلى كل بئر ، وبعد بضع ثوان ، قم بإزالة مصل العجل باستخدام ماصة. انقل البروتوبلاستات المعلقة إلى آبار لوحة الثقافة ، وقم بتغطية اللوحة بغطاء.

قبل الحصاد ، احتضن البروتوبلاست في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين في الظلام. بعد يومين ، انقل محلول البروتوبلاست إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الالتصاق سعة 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي للأنابيب عند 100 مرة G لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة. انقل 10 ميكرولترات من البروتوبلاست إلى شريحة زجاجية. راقب إشارات الفلورسنت تحت التألق أو المجهر متحد البؤر باستخدام البروتوبلاستات غير المحولة كعنصر تحكم سلبي.

تم تحضير خلايا البروتوبلاست من أعضاء مختلفة من فول الصويا البالغ من العمر 10 أيام وتمت ملاحظتها تحت المجهر. بالكاد تم هضم جدران الخلايا من نقص الذيلية والظلمة. وظلت بعض الخلايا مرتبطة ببعضها البعض.

في الرصاص الذيلي والجذر ، تمت إزالة جدران الخلايا فقط في جزء صغير من الخلايا. في المقابل ، لوحظ عدد كبير من البروتوبلاستات عند استخدام أحادي الأوراق. توضح الشتلات الموجودة في هذه الصورة من اليسار إلى اليمين الأوراق أحادية الأوراق غير الممتدة أو الموسعة للتو أو الموسعة بالكامل.

في حين أن كل من الأوراق أحادية الورقة غير الممتدة والممتدة للتو أدت إلى غلة عالية من البروتوبلاست ، فإن حجم البروتوبلاست من أحادي الأوراق الموسع للتو كان أكثر اتساقا من أحادي الأوراق غير الموسع. بالنسبة للأحادية الممتدة بالكامل ، كانت جدران الخلايا لا تزال سليمة في معظم الخلايا. اقترح اختبار مجموعة من الكميات المختلفة من الحمض النووي البلازميد أن الكميات الأكبر من الحمض النووي أدت إلى كفاءة تحويل أعلى.

أظهرت الصور متحدة البؤر لبروتوبلاستيات فول الصويا التي تحولت مع البناء الذي يعبر عن GFP المدمجة في جين E1 الخاص بالبقوليات ، توطين نووي لبروتين اندماج E1 GFP ، بما يتفق مع الدراسة السابقة التي استخدمت نظام نبات الأرابيدوبسيس البروتوبلاست. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين كل حالة تجريبية تجريبيا ، مثل اختيار المرحلة الصحيحة من مادة الأوراق ، وطول وقت هضم جدار الخلية ، وعمر التركيز ، وكمية الحمض النووي البلازميد للتحول. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الحمض النووي الريبي وتكرار البروتين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الجينات أو البروتينات المنظمة أو غير المنظمة؟

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على خلايا بروتولاست من عبيه الصويا عالية الجودة.