ساعد فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية لتدبير الكروماتين الوصول في خلايا الثدييات

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد إمكانية الوصول إلى الكروماتين للموضع الجيني عن طريق ربط الحمض النووي بالتساهمي بالبروتينات المرتبطة ، متبوعا بتنقية الحمض النووي الحر وتقديره الكمي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكروماتين حيث يمكن تحديد إمكانية الوصول إلى الحمض النووي ، بغض النظر عن نوع الخلية في الخلايا غير المعالجة وأيضا في الخلايا التي تخضع لإعادة تشكيل الكروماتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب استخدام الإنزيمات لشق الحمض النووي أو الأجسام المضادة التي تحتاج إلى معايرة لكل إعداد تجريبي.

يتمتع هذا البروتوكول بميزة إضافية تتمثل في أنه لا يتطلب أي معدات خاصة بخلاف Sonicator. سيوضح الإجراء أوليسيا ريتر وتابيا ريدلينجر ، وهما طالبان دكتوراه من مختبري. لبدء البروتوكول ، أضف الفورمالديهايد مباشرة إلى وسط نمو الخلايا التي تم زرعها قبل يوم واحد ، للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1٪ من الحجم من حيث الحجم.

احتضن الوسط لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقتل الأطباق يدويا كل دقيقتين. بعد ذلك ، أضف الجلايسين إلى التركيز النهائي البالغ 0.125 مولار لإخماد الفورمالديهايد. احتضن المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة واقتله كل دقيقتين.

استنشق الوسط ثم أضف PBS المثلج بعناية إلى جانب الطبق لغسل الخلايا. استنشق الوسط وكرر الغسيل بعناية مرتين. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من PBS المثلج واستخدم مكشطة خلية لفصل الخلايا ، إذا لزم الأمر.

انقلها إلى أنبوب تفاعل سعة 1.5 مل على الجليد. قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق عند 300 جرام وأربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد على الطاولة. استنشق بعناية وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل FAIRE عن طريق سحب العينة بعناية لأعلى ولأسفل عدة مرات. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة على الجليد. بعد الحضانة ، صوتنة الحمض النووي المتشابك لمشاركته في متوسط حجم من 200 إلى 300 زوج أساسي وتبريد العينات أثناء الصوتنة لتجنب تسخين العينة.

يعد تجزئة الحمض النووي أمرا بالغ الأهمية لهذه التجربة نظرا لأن حجم الشظايا يؤثر على حساسية محلول التقنية بأكملها ، لذلك من المهم إنشاء ظروف صوتنة بعناية مسبقا والتحقق من حجم شظايا الكروماتين في كل تجربة. الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة و 13 ، 000 جم عند أربع درجات مئوية. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب تفاعل جديد.

قسم العينات إلى 100 ميكرولتر من الحصص الصغيرة. استخدم حصة 100 ميكرولتر لعكس الرابط المتقاطع واستخدامها كمرجع لإجمالي الحمض النووي. أضف 10 ميكرولترات من RNase A واحتضن العينة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من البروتيناز K ، استخدم كتلة حرارية قابلة للبرمجة لاحتضان العينة لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية ثم لمدة ست ساعات عند 65 درجة مئوية لشق البروتينات وعكس الروابط المتقاطعة. احصل على كمية جديدة سعة 100 ميكرولتر ، وأضف 10 ميكرولتر من RNase A واحتضان العينة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، تابع العينة غير المتشابكة والعينة غير المتشابكة من القسم السابق بالتوازي.

أضف H2O للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 300 ميكرولتر. ثم أضف 300 ميكرولتر من كحول إيزوأميل كلوروفورم الفينول في غطاء الدخان والدوامة بقوة. الطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 13 ، 000 جم وأربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، انقل بعناية 280 ميكرولتر من المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب تفاعل جديد. تأكد من عدم أخذ أي حطام من الطور البيني ، الذي يحتوي أيضا على البروتينات ، وتخلص من المرحلة السفلية المتبقية كنفايات مذيبات عضوية. كرر العلاج وانقل بعناية 270 ميكرولتر من المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب تفاعل جديد.

أضف 270 ميكرولترا من الكلوروفورم في غطاء الدخان والدوامة بقوة. الطرد المركزي العينة. بعد الطرد المركزي ، انقل بعناية 250 ميكرولترا من المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب تفاعل جديد ، مع الحرص على عدم حمل أي حطام من الطور البيني.

تخلص من العينة المتبقية كنفايات مذيبات عضوية. ثم أضف 25 ميكرولترا من خمسة كلوريد صوديوم مولار ، و 250 ميكرولتر من الأيزوبروبانول وأضف خمسة ميكرولترات من الجليكوجين كحامل للحمض النووي. اقلب الأنابيب واحتضانها في درجة حرارة الغرفة.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينة لترسيب الحمض النووي. بعد ذلك ، اغسل حبيبات الحمض النووي ب 400 ميكرولتر من حجم 70٪ من حيث حجم الإيثانول وجهاز الطرد المركزي للعينة. اسحب المادة الطافية بعناية واترك الحبيبات تجف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد أن تجف الحبيبات ، أعد تعليقها في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. احتضان عينة الحمض النووي الحرة غير المتشابكة لمدة أربع ساعات عند 65 درجة مئوية لإزالة الروابط المتشابكة بين الحمض النووي. أخيرا ، حدد كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي وقم بتشغيل كمية صغيرة للتحقق من حجم الجزء على هلام الاغاروز بنسبة 2٪ من الوزن حسب الحجم.

تم تحفيز خلايا HeLA باستخدام عامل نخر الورم لمدة ساعة واحدة وتحليلها بواسطة FAIRE. تم تحديد النسبة بين الحمض النووي الحر مقابل الحمض النووي الكلي لمحفز ACTB ، الجين الذي يرمز إلى بيتا أكتين والتحكم الإيجابي ، ومنطقة الكروماتين غير المتجانسة على الكروموسوم 12 ، والتحكم السلبي ، ومشجع IL8. تم إنشاء هلام ملطخ ببروميد الإيثيديوم يتميز بأوقات صوتنة مختلفة ويشير إلى أن حجم الكروماتين الأمثل من 200 إلى 300 زوج أساسي تم الحصول عليه بعد 20 دقيقة من الصوتنة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون يومين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التسلسل العميق من أجل تحديد إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم. لا تنس أن العمل مع الفورمالديهايد وكلوروفورم الفينول يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب ضمان الاحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان وارتداء القفازات والتخلص المناسب من النفايات من خلال تنفيذ هذا الإجراء.