تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل

هنا يصف لنا نهجاً البروتين وحيد الخلية لتقييم المناعة المظهرية والوظيفية (سيتوكين داخل الخلايا التعريفي) تعديلات في عينات الدم كله المحيطية، حلل عبر الخلوي الشامل.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجال المناعة الذاتية مثل تحديد تشوهات تردد الخلايا والاختلافات الوظيفية مثل إنتاج السيتوكينات الرئيسية في وضع أمراض المناعة الذاتية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها يمكن أن تلتقط ذخيرة واسعة أو أنواع مختلفة من الخلايا والاختلافات الوظيفية من عينة دم محيطية يمكن الحصول عليها بسهولة. بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه العملية من أجل الحصول على التوقيت الصحيح لخطوات معالجة الدم ، وتصميم لوحة الأجسام المضادة ، وعملية الترميز الشريطي نفسها ، وتحليل بيانات الخلية المفردة عالية الأبعاد.

يعد نهج مناعة الأنظمة هذا مناسبا بشكل خاص لأمراض المناعة الذاتية مثل مرض الذئبة الحمراء حيث يكون خلل التنظيم المناعي منتشرا وواضحا في الدم المحيطي. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مهما لتوضيح توقيت الخطوات وأيضا لإظهار كيف يمكن ترميز عينات متعددة وتجميعها قبل تحليل القياس الخلوي الكتلي. لبدء هذا الإجراء ، ضع أنابيب البوليسترين ذات القاع المستدير الملصق من خمسة شروط مختلفة لمعالجة الدم الكامل على الرف.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من 37 درجة مئوية RPMI إلى كل أنبوب. بعد ذلك، أضف ملليلترا واحدا من الدم الكامل إلى كل أنبوب وقم بالماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلطها جيدا مع RPMI. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من ruxolitinib المخفف مسبقا إلى الأنبوب المسمى T ستة زائد خمسة R واخلطه جيدا.

ضع رف الأنابيب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية وابدأ في توقيت الحضانة. لمعالجة عينة T الصفرية ، قم بتحويل محتوى الأنبوب T الصفري بالكامل إلى أنبوب مخروطي مسمى يحتوي على 20 مل من 37 درجة مئوية ليز / مخزن مؤقت مثبت عند تركيز العمل. لتحسين استعادة الخلايا ، اشطف الأنبوب باستخدام محلول مؤقت / إصلاح واخلطه عن طريق قلب الأنبوب المخروطي.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بالتحلل والتثبيت. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 ضعف G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بصب المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من PBS المثلج البارد لتفتيت الحبيبات.

ثم املأ الأنبوب المخروطي بحجم 15 مليلتر باستخدام PBS. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من CSM لتفتيت الحبيبات.

بعد ذلك ، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مسمى لتلوين الأجسام المضادة. باستخدام عداد الخلايا الآلي ، عد الخلايا بعينة 10 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية ، واترك الحبيبات في حوالي 60 ميكرولتر من المتبقي. احتفظ بهذه الحبيبات على الجليد حتى تكتمل العينات من الظروف الأخرى على المعالجة. عند T يساوي 30 دقيقة ، انقل رف الأنبوب إلى غطاء مزرعة الأنسجة.

أضف 10 ميكرولتر من R848 بمعدل 0.1 جرام لكل ميكرولتر إلى أنبوب T six plus R848 واخلطه جيدا. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من LPS بمعدل 0.01 ميكروغرام لكل ميكرولتر إلى أنبوب T six plus LPS واخلطه جيدا. بعد ذلك ، أضف أربعة ميكرولترات من مثبط نقل البروتين إلى الأنابيب المسماة T six و T ستة زائد خمسة R و T ستة بالإضافة إلى LPS وأعد العينات إلى الحاضنة حتى يساوي T ست ساعات.

امزج العينات جيدا باستخدام ماصة P1000 كل ساعتين. عند T يساوي ساعتين ، أضف أربعة ميكرولترات من كوكتيل مثبط نقل البروتين إلى أنبوب T ستة بالإضافة إلى أنبوب R848. امزج جميع العينات وأعد الرف إلى الحاضنة حتى يساوي T ست ساعات.

عند T يساوي أربع ساعات، امزج العينات مع ماصة P1000 مرة أخرى. عند T يساوي ست ساعات ، قم بمعالجة T ستة ، T ستة زائد LPS ، T ستة زائد R848 ، و T ستة بالإضافة إلى خمسة أنابيب عينة دم R كما هو موضح لعينة T صفر. ثم, قم بتخزين الكريات في حجم CSM المتبقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمعالجتها لاحقا.

لترميز الخلايا الثابتة والمحللة ، قم بإذابة العينات من التخزين المنخفض 80 درجة مئوية ببطء على الجليد. قم بتخفيف المخزن المؤقت لبيرم الترميز الشريطي 10X باستخدام PBS بمقدار واحد إلى 10 وقم بعمل مخزن مؤقت كاف لثلاثة ملليلتر لكل عينة. املأ حضانة واحدة غير معقمة ب CSM وواحدة بمخزن مؤقت X للترميز الشريطي.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من CSM المثلج إلى العينات المذابة حديثا ، واخلطها جيدا ، وانقلها إلى أنابيب البولي بروبلين العنقودية ذات العلامات المسماة مسبقا. الآن ، خذ عينة سعة 10 ميكرولتر واحسب الخلايا باستخدام عداد خلوي آلي. قم بتطبيع عدد الخلايا في كل أنبوب عنقودي عن طريق إزالة حجم الخلايا الزائدة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 600 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من مخزن مؤقت واحد للترميز الشريطي X باستخدام ماصة متعددة القنوات وجهاز طرد مركزي عند 600 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استنشق من المادة الطافية.

قم بمحاذاة أنابيب الكتلة على حامل بنفس الترتيب كما هو موضح في مفتاح الرمز الشريطي بحيث يتطابق العينة مع الرمز الشريطي الخاص بها. أضف 800 ميكرولتر من مخزن مؤقت واحد للترميز الشريطي X بواسطة ماصة متعددة القنوات إلى جميع العينات في الأنابيب العنقودية دون لمس حبيبات الخلية لتقليل فقدان الخلايا. ثم ضع جانبا الرف مع أنابيب العنقود.

قم بإزالة شرائط أنبوب مجموعة الترميز الشريطي من 20 بلكس من 20 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 ميكرولتر من مخزن مؤقت واحد للترميز الشريطي X ، واخلطه جيدا ، وانقل 120 ميكرولترا من مزيج الباركود المعاد تعليقه إلى عينات الخلية المقابلة في أنابيب العنقود. امزج جيدا بواسطة ماصة متعددة القنوات حتى لا يكون هناك تلوث متبادل بين العينات المشفرة بشكل فردي.

احتضان الأنابيب العنقودية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للرموز الشريطية بتسمية الخلايا. بعد 30 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 600 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق المادة الطافية ، ثم أعد تعليقها في مليلتر واحد من CSM.

بعد ذلك ، أجهزة الطرد المركزي وإعادة التعليق في CSM مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 600 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وشفط المادة الطافية. باستخدام ماصة واحدة وباستخدام نفس الطرف ، انقل جميع كريات الخلايا في حوالي 70 إلى 80 ميكرولتر من الحجم المتبقي إلى أنبوب بوليسترين واحد.

لا تقم بإخراج طرف الماصة. ضع الماصة المفردة جانبا بهذا الطرف. باستخدام ماصة متعددة القنوات وأطراف جديدة، أضف 100 ميكرولتر من CSM إلى كل أنبوب عنقودي أصلي لزيادة استرداد الخلايا.

باستخدام الماصة المفردة مع الطرف الذي تم وضعه جانبا ، انقل جميع كريات الخلايا في 100 ميكرولتر من الحجم المتبقي إلى نفس أنبوب البوليسترين. أضف CSM لأعلى أنبوب البوليسترين إلى حوالي ثلاثة ملليلتر. عد وسجل رقم الخلية لمجموعة الباركود المجمعة.

ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 600 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وشفط المادة الطافية. انتقل إلى تلطيخ العينات المشفرة في نفس اليوم. يوضح هذا التخطيطي سير عمل تحفيز ومعالجة عينات الدم المحيطية ، بما في ذلك تخصيص حصص عينة الدم ، وتوقيت إضافة عوامل التحفيز ، وكوكتيل مثبط نقل البروتين ، وأوقات الحضانة حتى تحلل خلايا الدم الحمراء وتثبيتها.

اختيار العوامل المحفزة على مسارات الإشارات والسيتوكين المستهدفة للتقييم. بعد التثبيت وتحلل كرات الدم الحمراء ، تم ترميز عينات الخلايا الثابتة الفردية من متبرع سليم ، وتصنيفها ب 26 جسما مضادا ضد علامات السطح ، ونفاذة ، وملطخة ب 14 جسما مضادا ضد السيتوكينات. تظهر هنا استراتيجية البوابات المحدودة التي تمثل تحديد الخلايا الوحيدة العالية CD14.

من اليسار إلى اليمين ، كل مخطط ثنائي الأبعاد ممثل هو مجموعة فرعية من السكان الأصليين المسورة من المؤامرة ثنائية الأبعاد مباشرة إلى اليسار. باستخدام الخلايا الوحيدة العالية CD14 كممثل في ثماني مجموعات فرعية من الخلايا المناعية ، تم إجراء تحليل قياس الكتلة الخلوية على عينات الدم المحيطية من متبرع سليم في وقت بدون تحفيز وبعد التحفيز باستخدام ناهض TLR LPS و R848 ومنشط الخلايا التائية PMA ionomycin. يتم عرض مثال على تحريض السيتوكين في الخلايا الوحيدة العالية CD14 ويتم تصوير السيتوكينات المختارة ذات الخصوصية لعامل التحفيز المستخدم.

يحفز R848 بشكل انتقائي الوحدة الفرعية IL-12p40 و MCP1 في الخلايا الوحيدة العالية CD14 بينما لا يفعل LPS. في المقابل ، لا يحفز الأيونوميسين PMA السيتوكينات في الخلايا الوحيدة العالية CD14. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تحفيز الدم في حوالي سبع ساعات ويمكن إنجاز خطوة الترميز الشريطي في غضون ساعة تقريبا.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك توقيت الخطوات وأن تخطط مسبقا وفقا لذلك. بمجرد الانتهاء من هذا الإجراء ، يمكنك التفكير في تغيير ظروف تحفيز الدم في لوحة قياس الكتلة الخلوية من أجل تقييم استجابات الخلايا المناعية الخاصة بأهداف البحث الخاصة بك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخلاص استجابات السيتوكين من عينات الدم الكاملة وكيفية تجميع عينات متعددة في مجموعة مشفرة لتحليل قياس الكتلة الخلوية.