إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي
April 29th, 2017
توضح هذه المقالة جمع العينات ومعالجتها لتحليل قياس الكتلة الخلوية.
الهدف العام من عملية تحضير العينة هذه هو إنتاج تلطيخ قوي ومتسق للأجسام المضادة لعينات متنوعة لتمكين استجواب مجموعات الخلايا غير المتجانسة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة حول هوية الخلية وإشارات الخلية واستجابة الخلية في مجموعة خلايا معقدة غير متجانسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس مستويات البروتين ذات المعلمات العالية على مستوى الخلية الواحدة.
ستظهر هذا الإجراء أوندريتا دنكان ، طالبة دراسات عليا من مختبرنا. لكل عينة معلق خلية واحدة ، أعد تعليقها عند أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في وسط خال من المصل ، وأضف 500 ميكرولتر من 50 MicroMolar Cisplatin المحضر حديثا لكل 2/10 في الخلايا الست ، واحتضان العينات على شاكر مداري مع خلط مستمر في درجة حرارة الغرفة. بعد دقيقة واحدة ، قم بإخماد Cisplatin بحجم متساو من عازلة الغسيل وقم بالطرد المركزي للخلايا.
تخلص من المادة الطافية واغسل العينات مرتين أخريين عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل ، والطرد المركزي للخلايا ، وسكب مخزن الغسيل. اتبع ذلك بغسلتين في 500 ميكرولتر من PBS بالمثل ، وبالمثل ، ويقوم بالطرد المركزي للعينات والتخلص من المادة الطافية. بعد غسل PBS الثاني ، أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من PBS الطازج وقم بإصلاح الخلايا ب 500 ميكرولتر من 4٪ PFA.
ماصة الخلايا المراد خلطها. ثم ضع العينات على شاكر المداري مع الخلط المستمر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، واسكب المادة الطافية ، واتبع ذلك بغسل في PBS الطازج.
لاختراق الخلايا ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وتخلص من المواد الطافية. أعد تعليق العينات في PBS المتبقي عن طريق دوامة لطيفة ، وأضف على الفور ملليلتر واحد من الميثانول بنسبة 100٪ لكل 2/10 10 إلى الخلايا السادسة مع ماصة لطيفة. احتضان العينات بأربع درجات لمدة ساعة واحدة على الأقل ، وفي نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا.
بعد ذلك ، اسكب الميثانول. ثم اغسل الكريات في مليلتر واحد من مخزن الغسيل لكل مليلتر من الميثانول ، متبوعا بغسلتين أخريين في 500 ميكرولتر من محلول الغسيل الطازج. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مضبوطة على 50 ميكرولتر ، انقل مخزن الغسيل المتبقي من كل حبيبات إلى أنبوب من كوكتيل الجسم المضاد المناسب.
تقومالماصة بعمل نسخة احتياطية من المحلول المركب دون سحب الهواء إلى الطرف عن طريق إبقاء المكبس مكتطا جزئيا. ثم انقل طرف الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول الغسيل دون تحرير المكبس. حرر المكبس ، وارسم المخزن المؤقت للغسيل لحجم كوكتيل إجمالي للأجسام المضادة يبلغ 50 ميكرولترا وقم بتسمية العينة المقابلة المناسبة بكوكتيل الأجسام المضادة المستنشقة عن طريق سحب العينة اللطيف.
بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز المستمر ، اغسل العينات أربع مرات ، واسكب مخزن الغسيل في كل مرة. لتسمية الخلايا بالإيريديوم ، أعد تعليق الكريات النهائية في 500 ميكرولتر من PBS ، متبوعا بإضافة 500 ميكرولتر من أربعة بالمائة من PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من 62.5 نانومولار من الإيريديوم و PFA المحضر حديثا إلى العينات لمدة 15 دقيقة أخرى من اهتزاز درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا ، واسكب المادة الطافية ، وتبعها غسلتان في 500 ميكرولتر من 0.1 في المائة BSA والماء منزوع الأيونات المصفى. قم بتحليل العينات عن طريق إضافة حبات التطبيع في آبار ألواح العينة ، وسحب الخلايا في هذه الآبار ثم إجراء قياس الكتلة الخلوية في غضون 24 ساعة. بعد تطبيع شدة الإشارة ، يمكن إزالة حبات المعايرة من البيانات عن طريق البوابات على مجموعة سلبية حبة الإيريديوم 191.
يمكن بعد ذلك بوابات أحداث الخلية المفردة لإزالة الحطام ومضاعفات الخلايا باستخدام مخطط ثنائي المحور للتعبير السلبي للإيريديوم 193 مقابل طول الحدث. يمكن استخدام ملصقات سيسبلاتين لقياس مقدار عمق الخلية. على سبيل المثال ، يتم عرض عينات تحتوي على كميات منخفضة وأعلى من الخلايا الميتة.
يمكن إزالة الخلايا الميتة عن طريق إبعاد مجموعة البلاتين 198 الإيجابية ، وينتج عن الترميز الشريطي فصلا واضحا للعينات ضمن معلمات الترميز الشريطي ، مما يسمح بتعيين الخلايا إلى هويات العينة الأصلية. يمكن استخدام ملصقات متعاطي المخدرات بالحقن للكشف عن خلايا الوجه الأمريكية التي لوحظت هنا. بعد التطبيع الأولي وإلغاء الترميز الشريطي والبوابات ، يمكن تحليل البيانات عالية الأبعاد باستخدام خوارزمية SPADE لإنشاء تمثيل أقل أبعاد للبيانات أكثر قابلية للتفسير المرئي.
بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون أربع إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل فقدان العينة أثناء القيام بخطوة الغسيل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات لتحليل قياس الكتلة الخلوية.
لا تنس أن العمل مع أزيد الصوديوم يمكن أن يكون خطيرا ، لذلك يجب عليك استخدام الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند تنفيذ هذا الإجراء.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة جمع ومعالجة العينات لتحليل القياس الخلوي الشامل. تهدف الطريقة إلى إنتاج تلطيخ موحد للأجسام المضادة لاستجواب مجموعات الخلايا غير المتجانسة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- القياس الخلوي الشامل
الخلفية
- يتيح القياس الخلوي الشامل قياس مستويات البروتينات متعددة المعلمات على مستوى الخلية المفردة.
- من المفيد لفهم هوية الخلية والإشارات.
- التقنية قابلة للتطبيق على مجموعات الخلايا غير المتجانسة المعقدة.
- إعداد العينة ضروري للحصول على نتائج قوية.
هدف الدراسة
- لإثبات عملية إعداد العينة للقياس الخلوي الشامل.
- لتمكين استجواب مجموعات الخلايا المتنوعة.
- لتوفير رؤى حول استجابات الخلايا وتفاعلاتها.
الطرق المستخدمة
- إعادة تعليق عينات تعليق الخلايا المفردة في وسط خالٍ من المصل.
- استخدام سيسبلاتين طازج لمعاملة الخلايا.
- الحضانة على شاكر مداري لمزج متسق.
- الطرد المركزي وغسل الخلايا بعد العلاج.
النتائج الرئيسية
- تبيين تقنية إعداد العينة الفعالة.
- تحقيق تلطيخ موحد للأجسام المضادة عبر العينات.
- تسهيل التحليل عالي المعلمات على مستوى الخلية المفردة.
- الحصول على رؤى حول مجموعات الخلايا غير المتجانسة.
الاستنتاجات
- تعزز الطريقة القدرة على تحليل مجموعات الخلايا المعقدة.
- إعداد العينة القوي ضروري للحصول على نتائج قياس خلوي شاملة دقيقة.
- يمكن لهذه التقنية تعزيز البحث في بيولوجيا الخلية وعلم الأعصاب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-parameter single-cell protein analysis, supporting deep interrogation of heterogeneous cell populations in drug discovery. Reliable sample preparation is essential for generating consistent, reproducible data that informs target validation and mechanistic de-risking. This protocol helps biopharma R&D teams reduce variability and improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables multiplexed protein profiling to clarify cellular identity and signaling states in complex tissues.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven interrogation of drug target engagement and pathway modulation at single-cell resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-dimensional readouts for assessing compound effects across diverse cell types.
- Operational Value: Establishes reproducible staining and fixation procedures critical for assay scalability and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery and phenotypic characterization in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cellular responses to support go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative, single-cell resolution data that complements bulk assays and functional screens.
- Discovery Biology: Enables detailed mapping of cellular heterogeneity and dynamic protein expression changes in response to perturbations.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs suitable for hit validation and mechanism-of-action deconvolution.
- Analytics: Produces high-dimensional data requiring computational gating and normalization for accurate interpretation.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical models by enabling consistent immunophenotyping across sample sets.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized sample preparation foundation for reusable mass cytometry platforms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through comprehensive, single-cell resolution protein profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and minimizes technical variability via standardized washing, fixation, and permeabilization steps.
- Strategic Value: Improves target selection and lead optimization by reducing biological ambiguity in complex samples.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization by revealing off-target effects and cell-state-specific responses early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry principles, antibody panel design, and metal-conjugated reagent handling.
- Depends on access to a mass cytometer, centrifugation equipment, and orbital shakers for consistent sample processing.
- Necessitates standardized operating procedures for reagent preparation, particularly Cisplatin and methanol-based permeabilization, to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to diverse sample types such as primary tissues, blood, or cultured cells.
- Includes practical limitations related to sample loss during multiple wash steps and the need for careful titration of antibody cocktails to minimize background signal.
