Name: إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: تعلم إعداد العينات لتحليل القداس الخلوي باستخدام Cisplatin والأجسام المضادة. تتيح هذه الطريقة قياس مستويات البروتينات عند الخلايا الفردية لفهم الهوية الخلوية والإشارات في علم الأعصاء وعلم الأحياء الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم العمل في مختبر بارتون بمنحة من معهد الوقاية من السرطان وأبحاثه في تكساس (CPRIT RP110471). تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال زمالة منحة تدريبية ل Ryan L. McCarthy من برنامج التدريب الصحي التابع للمعاهد الوطنية في علم الوراثة الجزيئية 5 T32 CA009299. يتم دعم المرفق الأساسي الذي يحافظ على آلة قياس الكتلة ويديرها بمنحة CPRIT (RP121010) ومنحة المعاهد الوطنية للصحة الأساسية (CA016672).

<ol><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398(2012).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li>
<li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li>
<li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li>
<li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li>
<li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).</li>
<li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival%2Fproliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li>
<li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li>
<li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li>
<li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Measure+for+measure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li>
<li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li>
<li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-FISH%3A+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

بروتوكول المقدمة هنا قد استخدمت بنجاح لمعالجة مختلف خطوط مثقف الخلايا (H1 و H9 hESCs، mESCs، MCF7، HEK 293، KBM5، HMEC، MCF10a) وعينات الأنسجة الابتدائية (الماوس نخاع العظام، والماوس الكبد الجنينية، والكبار الماوس الكبد والورم الماوس). بغض النظر عن المصدر، أي نوع من الأنسجة التي يمكن فصلها إلى الخلايا وحيدة مع الحفاظ على الدولة الخلوية وينبغي أن تكون قابلة للتحليل من قبل كتلة الخلوي، ولكن قد يتطلب بعض التحسين البروتوكول. ومن المهم أن نلاحظ أن بعض الحواتم قد تتأثر علاجات محددة التف...

الخلوي تمكن من قياس وقت واحد من الأهداف الأجسام المضادة متعددة على مستوى خلية واحدة عبر أعداد كبيرة من الخلايا. في التقليدية التدفق الخلوي القائم على مضان، وعدد من المعلمات التي يمكن قياسها كميا محدودة بسبب التداخل الطيفي بين طيف الانبعاث من fluorophores متعددة، الأمر الذي يتطلب حسابات التعويضات التي تزداد تعقيدا كما يزيد عدد المعلمات. وتعالج هذه القيود من قبل كتلة الخلوي، حيث تم الكشف عن الأجسام المضادة المعادن مترافق الثقيلة وكميا من قبل وقت الرحلة (TOF) مطياف الكتلة لتوسيع كبيرة في عدد من المعلمات التي تم جمعها في وقت واحد وتسفر عن الأبعاد الشخصية نسبة عالية من البروتين وفرة لكل خلية على حدة. فهم أساسي للعمل من كتلة الخلوي الصك هو مفيد للمستخدم، وربما تكون ضرورية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. للحصول على وصف أكثر دقة من ضبط وتشغيل الجهاز الخلوي الجماعي،انظر المخطوطة ذات الصلة 1. لفترة وجيزة، وصفت عينة الخلية مع لجنة من الأجسام المضادة مترافق المعدنية تستهدف علامات سطح الخلية والبروتينات حشوية، والبروتينات النووية والبروتينات محددة لونين أو غيرها الحواتم الفائدة (الشكل 1I). يتم تحميل الخلايا المسمى على الجهاز، إما في وقت واحد عن طريق الحقن اليدوي أو استخدام الاوتوماتيكى أن عينات من لوحة 96-جيدا. يتم حقن الخلايا تحميلها من خلال البخاخات، والذي يولد رذاذ من قطرات سائلة التغليف الخلايا (الشكل 1ii). يتم وضع هذا الرش بحيث يتم المتأينة الخلايا عن طريق الشعلة الأرجون البلازما. هذا التأين يولد سحابة الجسيمات التي تتألف من جميع الذرات المكونة من كل خلية (الشكل 1iii). كما تنتقل هذه السحابة الجسيمات إلى كاشف، يتم فصل ذرات منخفضة الكتلة الذرية من الأيونات الشامل عالية من قبل مرشح الشامل رباعي. استمرت المتبقية أيونات جماعية عالية لكاشف، حيث abund<html> وكميا تعصب كل النظائر (الشكل 1iv). البيانات الخام التي تم جمعها من قبل كاشف، وتحليلها من قبل كتلة البرنامج الخلوي أداة لتحديد الأحداث الخلية. لكل حدث الخلية التي تم تحديدها، وكميا إشارة الكشف في كل قناة وحفظها إلى ملف ناتج .fcs. القنوات كتلة تستخدم للكشف عن الأجسام المضادة المعادن الثقيلة مترافق يحمل الحد الأدنى من التداخل الطيفي، والتي تتراوح 0-4٪ مع معظم المساهمات أقل من 1٪. وبسبب هذا المنخفض عبر الحديث بين القنوات، وليس من الضروري عموما لتحويل البيانات مع مصفوفة التعويض أمام تحليل 2. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر أثناء تصميم لوحة التجريبية من الأجسام المضادة للتأكد من أن الأجسام المضادة مع حاتمة عالية وفرة-لم يتم تعيين إلى قناة الجماهيرية التي تساهم إشارة إلى قناة المسندة إلى الأجسام المضادة وفرة منخفضة، لأن هذا قد خلق السكاني المرتفع بشكل مصطنع في القناة تلقي مساهمة إشارة. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; إعداد الدقيق للعينات لكتلة تحليل الخلوي تعتمد اعتمادا كبيرا على أنواع العينات التي يتم جمعها والفرضية التجريبية التي يجري اختبارها. نحن نقدم أمثلة على بروتوكولين لحصاد أنواع مختلفة من الخلايا (خلايا جذعية جنينية بشرية) والخلايا الأولية (الماوس ورم الثدي الخلايا الظهارية عزل). عند بداية دراسة الخلوي الجماعي، فإنه من المستحسن أن أولا بتنفيذ تجربة رائدة صغيرة للتأكد من أن جميع البروتوكولات والأجسام المضادة ليتم الاستفادة منها تعمل بشكل جيد في يد المحقق. وهذا أمر ضروري وخصوصا عندما تكون لاستخدامها الأجسام المضادة مترافق العرف، كرد فعل تخفيض جزئي خلال تصريف الأجسام المضادة لديه القدرة على تعطيل الجسم المضاد تقارب. لذلك، يحتاج كل الأجسام المضادة مخصصة ليتم التحقق من صحتها تجريبيا لضمان دقة البيانات. وتشمل الاعتبارات الأخرى تحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة سطح الخلية لاستخدامها في فحص ستعترف الحواتم الخاصة بهم بعد تثبيت أو إذا كانت NEإد ليتم تطبيقها على العيش الخلايا. بعض التثبيت قد منع تلطيخ السليم مع الأجسام المضادة سطح الخلية كما هو معروف أن تحدث مع الببتيد MHC تلطيخ 3 و 4. أداء سطح الخلية تلوين الأجسام المضادة على الخلايا الحية قد يكون من الضروري بالنسبة لبعض الأجسام المضادة، ولكن هذا يحول دون خيار المتوازية قبل وضع العلامات الأجسام المضادة كما يتم تنفيذ معظم الطرق المتوازية بعد تثبيت 5 على الرغم من أن القائم على الأجسام المضادة المتوازية 6 و 7 استثناء. عند تحديد عدد الخلايا لتكون على استعداد لتحليل، فمن المهم أن نعرف أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الخلايا تحميلها على الجهاز سوف يتم الكشف عن وإنتاج البيانات. ومن المقرر في المقام الأول إلى عدم فعالية هذه الخسارة عندما يرش على البخاخات العينة في الشعلة. فقدان في المئة الدقيقة تعتمد على كتلة الخلوي إعداد الجهاز ونوع من الخلايا ولكن يمكن أن تتراوح 50-85٪ ويجب أن تكونفي الاعتبار عند تصميم التجربة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لالخلايا 2x10 6 لكل عينة ولكن يمكن تكييفها لمعالجة أحجام أصغر أو أكبر عينة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع الحد الأدنى من التعديلات لأحجام عينة من 1 × 06-04 أكتوبر × 10 6، ومع ذلك فمن الأهمية بمكان أن تظل حجم العينة بما يتفق ضمن التجربة. التغيرات في عدد الخلايا يمكن أن تؤثر على شدة المتوازية وتلوين الأجسام المضادة ويجب أن تبقى متسقة تقريبا عبر عينات لمقارنة مباشرة. ، ينبغي إجراء بعض الإجراءات، مثل وضع العلامات خلية ميتة ووضع العلامات DNA في الغالبية العظمى، إن لم يكن جميع التصاميم التجريبية. وضع العلامات على الخلايا الميتة في التجارب تحليل فقط علامات سطح يمكن تحقيقه باستخدام Rh103، ولكن Rh103 ينبغي تجنبها للتجارب التي تتطلب permeabilization كما أنه يؤدي إلى فقدان تلطيخ. لالتجارب التي تنطوي permeabilization، فإنه من المستحسن للاستفادة سيسبلاتين <sحتى الطبقة = &quot;XREF&quot;&gt; 8، وعندما يكون ذلك ممكنا، والأجسام المضادة الاعتراف PARP المشقوق أو المشقوق كاسباس للكشف عن خلايا أفكارك والميتة. يمكن عينات المتوازية خفض استهلاك الأجسام المضادة، وانخفاض اكتساب الوقت والقضاء على عينة إلى عينة تقلب 9. عملية المتوازية ينطوي على تطبيق نموذج التعليمات البرمجية الخاصة فريدة من نوعها لجميع الخلايا، والذي يستخدم لتعيين كل خلية لنموذج المنشأ. بعد المتوازية العينات قد تكون مجمعة قبل تلوين الأجسام المضادة، وهي العملية التي تضمن ملطخة جميع العينات على حد سواء. لتقليل الخطأ التجريبي، فإنه من الحكمة أن الباركود وتجميع أي عينات التي سيتم مقارنة مباشرة مع بعضها البعض. حاليا توجد عدة طرق لالمتوازية عينات للكتلة تحليل الخلوي 5، 6، 7، يتم عرض اثنين منها هنا (انظر أدناه). مع reagen متاح حاليانهاية الخبر أنه من الممكن تحديد وفرة من 38 أهداف الأجسام المضادة، وتحديد الخلايا في مرحلة S-10، تمييز الخلايا الحية والميتة 8 وقياس مستويات الخلايا من نقص الأكسجين 11 في تجربة المضاعفة من عينات متعددة. هذه القدرة على جمع البيانات خلية واحدة عالية المعلمة للسكان خلية كبيرة تمكن التنميط محسنة من السكان الخلية غير متجانسة للغاية وأنتجت بالفعل عددا من الأفكار البيولوجية الجديدة 12 و 13 و 14 و 15 و 16. تقطير البيانات المعقدة الناتجة على المعلومات التأويل قد يتطلب استخدام الخوارزميات الحسابية بما في ذلك شجرة الامتداد التقدم من كثافة الأحداث تطبيع (SPADE) 17 و 18 viSNE. تقدم هذه المقالة الوصولنظرة عامة عن كيفية تصميم وتنفيذ كتلة الخلوي التجربة ويقدم التحليل الأساسي للكتلة الخلوي البيانات.

مجموعة <table><tbody><tr><td>متوسطة mTeSR1</td><td>تقنيات الخلايا الجذعية</td><td>05850</td><td>دافئ في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>دافئ عند 37 &nbsp ؛ &deg; C قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>تقنيات الخلايا الجذعية</td><td>Accutase</td><td>07920</td><td>دافئة عند 37 &nbsp ؛ &deg; C قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>ألبومين مصل الأبقار</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات مخزن محلول</td><td>ملحي Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>معرف الخلية Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>المقدم في 1 & nbsp ؛ </td></tr><tr><td>معرف الخلية mM Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>المقدم في 1 &nbsp ؛ </td></tr><tr><td>معرف الخلية mM Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>متوفر في 1 & nbsp ؛ ملم</td></tr><tr><td>سيسبلاتين</td><td>إنزو علوم الحياة</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>قابل للذوبان إلى 25 &nbsp ؛ ملغ / مل في DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2'-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>قابل للذوبان إلى 74 & nbsp; ملغ / مل في 0.2 &nbsp ؛ N هيدروكسيد الصوديوم</td></tr><tr><td>الروديوم 103 عامل تداخل</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>ميثانول</td><td>فيشر</td><td>BP1105-4</td><td>البرد عند -20 & nbsp ؛ &deg; C قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 مل أنابيب القاع المستديرة</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 مل 35 &# 956 ؛ م أنابيب غطاء المرشح Falcon</td><td></td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ أربعة عناصر معايرة الخرز</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase من Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>مشرط يمكن التخلص منه # 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

كتلة يستخدم الخلوي الأجسام المضادة مترافق مع تسميات المعادن الثقيلة، وهو النهج الذي زاد بشكل كبير من عدد من المعلمات والفرص المتاحة لتحليل عميق إلى ما وراء ما هو ممكن مع تدفق القائم على مضان التقليدية الخلوي. كما هو الحال مع أي تكنولوجيا جديدة، وهناك خطوات الهامة التي تساعد على ضمان الجيل موثوق للبيانات عالية الجودة. المقدمة هنا هو بروتوكول الأمثل الذي يشتمل على تقنيات متعددة لتجهيز عينات من الخلايا لتحليل الخلوي الجماعي. سوف الأساليب المذكورة هنا تساعد المستخدم تجنب المخاطر المشتركة وتحقيق نتائج متسقة عن طريق تقليل التباين، مما قد يؤدي إلى عدم دقة البيانات. لإعلام التصميم التجريبي، وتغطي الأساس المنطقي وراء الخطوات الاختيارية أو بديلة في البروتوكول وفعاليتها في كشف نتائج جديدة في علم الأحياء من نظام يجري التحقيق فيها. وأخيرا، يتم تقديم بيانات تمثيلية لتوضيح النتائج المتوقعة من PRESENTE تقنياتد هنا.

بروتوكول المعروضة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمجموعة متنوعة واسعة من عينات خلايا مستنبتة والابتدائية مع تعديلات طفيفة فقط. تبعا لمتطلبات التجربة، فإنه لا يمكن أن يؤديها بطريقة نموذجية عند بعض العناصر، مثل المتوازية أو سطح الخلية تلطيخ، ليست ضرورية. المستخدمة في مجملها هذا البروتوكول يتيح إعداد كتلة المضاعفة الخلوي عينات المسمى لتحديد السكان ميت استبعاد الخلية، S-مرحلة والملون لتقدير حجم ما يصل الى 38 اهداف الأجسام المضادة. <p class="jove_co...

توضح هذه المقالة جمع العينات ومعالجتها لتحليل قياس الكتلة الخلوية.

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

الهدف العام من عملية تحضير العينة هذه هو إنتاج تلطيخ قوي ومتسق للأجسام المضادة لعينات متنوعة لتمكين استجواب مجموعات الخلايا غير المتجانسة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة حول هوية الخلية وإشارات الخلية واستجابة الخلية في مجموعة خلايا معقدة غير متجانسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس مستويات البروتين ذات المعلمات العالية على مستوى الخلية الواحدة.ستظهر هذا الإجراء أوندريتا دنكان ، طالبة دراسات عليا من مختبرنا. لكل عينة معلق خلية واحدة ، أعد تعليقها عند أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في وسط خال من المصل ، وأضف 500 ميكرولتر من 50 MicroMolar Cisplatin المحضر حديثا لكل 2/10 في الخلايا الست ، واحتضان العينات على شاكر مداري مع خلط مستمر في درجة حرارة الغرفة. بعد دقيقة واحدة ، قم بإخماد Cisplatin بحجم متساو من عازلة الغسيل وقم بالطرد المركزي للخلايا.تخلص من المادة الطافية واغسل العينات مرتين أخريين عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل ، والطرد المركزي للخلايا ، وسكب مخزن الغسيل. اتبع ذلك بغسلتين في 500 ميكرولتر من PBS بالمثل ، وبالمثل ، ويقوم بالطرد المركزي للعينات والتخلص من المادة الطافية. بعد غسل PBS الثاني ، أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من PBS الطازج وقم بإصلاح الخلايا ب 500 ميكرولتر من 4٪ PFA.ماصة الخلايا المراد خلطها. ثم ضع العينات على شاكر المداري مع الخلط المستمر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، واسكب المادة الطافية ، واتبع ذلك بغسل في PBS الطازج.لاختراق الخلايا ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وتخلص من المواد الطافية. أعد تعليق العينات في PBS المتبقي عن طريق دوامة لطيفة ، وأضف على الفور ملليلتر واحد من الميثانول بنسبة 100٪ لكل 2/10 10 إلى الخلايا السادسة مع ماصة لطيفة. احتضان العينات بأربع درجات لمدة ساعة واحدة على الأقل ، وفي نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا.بعد ذلك ، اسكب الميثانول. ثم اغسل الكريات في مليلتر واحد من مخزن الغسيل لكل مليلتر من الميثانول ، متبوعا بغسلتين أخريين في 500 ميكرولتر من محلول الغسيل الطازج. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مضبوطة على 50 ميكرولتر ، انقل مخزن الغسيل المتبقي من كل حبيبات إلى أنبوب من كوكتيل الجسم المضاد المناسب.تقوم الماصة بعمل نسخة احتياطية من المحلول المركب دون سحب الهواء إلى الطرف عن طريق إبقاء المكبس مكتطا جزئيا. ثم انقل طرف الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول الغسيل دون تحرير المكبس. حرر المكبس ، وارسم المخزن المؤقت للغسيل لحجم كوكتيل إجمالي للأجسام المضادة يبلغ 50 ميكرولترا وقم بتسمية العينة المقابلة المناسبة بكوكتيل الأجسام المضادة المستنشقة عن طريق سحب العينة اللطيف.بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز المستمر ، اغسل العينات أربع مرات ، واسكب مخزن الغسيل في كل مرة. لتسمية الخلايا بالإيريديوم ، أعد تعليق الكريات النهائية في 500 ميكرولتر من PBS ، متبوعا بإضافة 500 ميكرولتر من أربعة بالمائة من PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من 62.5 نانومولار من الإيريديوم و PFA المحضر حديثا إلى العينات لمدة 15 دقيقة أخرى من اهتزاز درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا ، واسكب المادة الطافية ، وتبعها غسلتان في 500 ميكرولتر من 0.1 في المائة BSA والماء منزوع الأيونات المصفى. قم بتحليل العينات عن طريق إضافة حبات التطبيع في آبار ألواح العينة ، وسحب الخلايا في هذه الآبار ثم إجراء قياس الكتلة الخلوية في غضون 24 ساعة. بعد تطبيع شدة الإشارة ، يمكن إزالة حبات المعايرة من البيانات عن طريق البوابات على مجموعة سلبية حبة الإيريديوم 191.يمكن بعد ذلك بوابات أحداث الخلية المفردة لإزالة الحطام ومضاعفات الخلايا باستخدام مخطط ثنائي المحور للتعبير السلبي للإيريديوم 193 مقابل طول الحدث. يمكن استخدام ملصقات سيسبلاتين لقياس مقدار عمق الخلية. على سبيل المثال ، يتم عرض عينات تحتوي على كميات منخفضة وأعلى من الخلايا الميتة.يمكن إزالة الخلايا الميتة عن طريق إبعاد مجموعة البلاتين 198 الإيجابية ، وينتج عن الترميز الشريطي فصلا واضحا للعينات ضمن معلمات الترميز الشريطي ، مما يسمح بتعيين الخلايا إلى هويات العينة الأصلية. يمكن استخدام ملصقات متعاطي المخدرات بالحقن للكشف عن خلايا الوجه الأمريكية التي لوحظت هنا. بعد التطبيع الأولي وإلغاء الترميز الشريطي والبوابات ، يمكن تحليل البيانات عالية الأبعاد باستخدام خوارزمية SPADE لإنشاء تمثيل أقل أبعاد للبيانات أكثر قابلية للتفسير المرئي.بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون أربع إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل فقدان العينة أثناء القيام بخطوة الغسيل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات لتحليل قياس الكتلة الخلوية.لا تنس أن العمل مع أزيد الصوديوم يمكن أن يكون خطيرا ، لذلك يجب عليك استخدام الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند تنفيذ هذا الإجراء.

sample-preparation-for-mass-cytometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يتم وصف الخطوات الضرورية لضبط اليومية والاستفادة المثلى من أداء عداد الكريات الشامل CyTOF. وتناقش التعليقات على إعداد العينات ومعدل التدفق...

الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

يسلط هذا الفيديو الضوء على طريقة بروتينية أحادية الخلية تستخدم الأجسام المضادة المترافقة بالمعادن الثقيلة للترميز الشريطي للخلية المميزة. بعد ذلك ، يتم تطبيق التلوين المناعي وقياس الكتلة الخلوية لتقييم التغيرات المناعية والوظيفية في الخلايا المناعية المشتقة من الدم البشري الكامل.

مقايسة الترميز الشريطي للتوصيف الظاهري والوظيفي للخلايا المناعية

يعد استخدام أخذ عينات الفرشاة الخلوية لجمع الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة من باطن عنق الرحم تقنية طفيفة التوغل توفر عينات لتحليل مناعة الجهاز التناسلي الأنثوي. في هذا البروتوكول ، نصف جمع عينات الفرشاة الخلوية وعزل الخلايا المناعية لمقايسات قياس التدفق الخلوي.

جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

هنا يصف لنا نهجاً البروتين وحيد الخلية لتقييم المناعة المظهرية والوظيفية (سيتوكين داخل الخلايا التعريفي) تعديلات في عينات الدم كله المحيطية، حلل عبر الخلوي الشامل.

تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل

يصف هذا البروتوكول كيفية عزل خلايا القرنية الجلدية من نماذج الماوس، ووصمة عار مع الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، وتحليل الخلايا الملونة عن طريق قياس الخلايا الشاملة من أجل تحديد نمط التعبير من البروتينات ذات الأهمية في مراحل دورة الخلية المختلفة.

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

هنا، نقدم بروتوكول لمعالجة نخاع العظم الطازج (BM) معزولة عن الماوس أو الإنسان لالكتلة عالية الأبعاد الخلايا (الخلايا من قبل وقت الرحلة، CyTOF) تحليل الخلايا العدلية النسب.

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

في هذا البروتوكول ، نصف كيفية تحضير خلايا الثدييات لتحليل البروتينات أحادية الخلية عبر قياس الطيف الكتلي باستخدام الكواشف والمعدات المتاحة تجاريا ، مع خيارات لكل من السحب اليدوي والآلي.

تحضير البروتينات أحادية الخلية لتحليل قياس الطيف الكتلي باستخدام تحلل الحرارة بالتجميد وحامل متساوي الضغط

هنا ، نصف طريقة جديدة لقياس التدفق الخلوي للعزل المحتمل لوحدة تشكيل الانفجار المبكر erythroid (BFU-e) ووحدة تشكيل المستعمرة erythroid (CFU-e) مباشرة من نخاع عظم الفأر الطازج والطحال. هذا البروتوكول ، الذي تم تطويره بناء على بيانات النسخ أحادية الخلية ، هو الأول الذي يعزل جميع أسلاف الإريثرويد في الأنسجة بنقاوة عالية.

تحديد وعزل وحدة تشكيل الانفجار ووحدة تشكيل المستعمرات أسلاف الإريثرويد من أنسجة الفأر عن طريق قياس التدفق الخلوي

هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس المستقلبات بدقة وموثوقية في أنواع الخلايا النادرة. تتيح التحسينات التقنية ، بما في ذلك سائل غمد معدل لفرز الخلايا وتوليد عينات فارغة ذات صلة ، إجراء تقدير كمي شامل للمستقلبات بإدخال 5000 خلية فقط لكل عينة.

الأيض المستهدف على الخلايا الأولية النادرة

يهدف هذا البروتوكول إلى الحفاظ على مستقلبات الخلايا لقياس الطيف الكتلي أحادي الخلية (SCMS) من خلال الجمع بين غسل محلول الملح المتطاير ، والتبريد السريع للنيتروجين السائل ، والتجفيف بالتجميد ، والتخزين -8 درجة مئوية. يوضح أن تبريد النيتروجين السائل ضروري للحفاظ على ملامح المستقلب ، بينما يجب تقليل التخزين البارد لفترات طويلة لمنع التغيرات الأيضية.

تحضير العينة لدراسات التمثيل الغذائي لقياس الطيف الكتلي أحادي الخلية: غسل الخلايا المركبة والتبريد والتجفيف والتخزين

يقدم هذا البروتوكول طريقة مفصلة لعزل المعلقات عالية الجودة أحادية الخلية من أنسجة رئة الفأر الصحية والحاملة للأورم. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على sRNA-seq، وتحليل تدفق القياس الخلوي، والعزل الأولي للخلايا.

التحضير الأمثل للأنسجة الرئوية الحاملة للورم في الفأر الكامل لقياس تدفق الخلايا وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

تعلم إعداد العينات لتحليل القداس الخلوي باستخدام Cisplatin والأجسام المضادة. تتيح هذه الطريقة قياس مستويات البروتينات عند الخلايا الفردية لفهم الهوية الخلوية والإشارات في علم الأعصاء وعلم الأحياء الخلوي.

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

استكشف المزيد من الفيديوهات