تحقيق قوة مباشرة لقياس التكامل الميكانيكية بين النواة وسيتوسكيليتون

في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة ميكروبيبيتي لمباشرة تطبيق قوة الخاضعة للرقابة على النواة في خلية حية. ويسمح هذا الفحص الاستجواب للخصائص الميكانيكية النووية في الخلية الحية، وملتصقة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الميكانيكا النووية. على سبيل المثال ، ما القوة المطلوبة لتشوه النواة في الخلية؟ ما هي مساهمات المكونات الخلوية والنووية في المقاومة النووية للتشوه؟

أم أن الاقتران النووي مع الهياكل الخلوية يختلف باختلاف نوع الخلية؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتطبيق قوة التحقيق لتشويه الهيكل الخلوي المتكامل في خلية حية ملتصقة. على الرغم من استخدام هذه الطريقة لتقديم نظرة ثاقبة للخصائص الميكانيكية النووية في خلايا NIH-3T3 ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أي نوع من الخلايا الملتصقة ، مثل استكشاف الخصائص الميكانيكية النووية في خلايا Hutchinson-Gilford progerial.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتغطية طبق زجاجي قاع بحجم 35 ملم ب 5 ميكروغرام لكل مليلتر من الفيبرونكتين. بعد ذلك ، استزراع خلايا الخلايا الليفية NIH 3T3 في DMEM مع 10٪ مصل بقري متبرع و 1٪ بنسلين ستربتومايسين على الطبق المغطى عند 37 درجة مئوية حتى التقاء مطلوب. قبل التجربة مباشرة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، متبوعا بغسل واحد بوسط نمو كامل.

بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط النمو الكامل إلى طبق زجاجي القاع. في هذا الإجراء، قم بتشغيل الحاقن الدقيق. باستخدام قطارة زيت الغاطس، ضع قطرة من زيت الغمر على العدسة الموضوعية.

ثم قم بتثبيت الطبق بإحكام على حامل الأطباق وقم بتحميل حامل الأطباق على المسرح. يرجى ملاحظة أنه يجب الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال التجربة. بعد ذلك ، اضبط ارتفاع الهدف لتركيز الخلايا.

حرك مرحلة المجهر للعثور على الخلية ذات الأهمية. باستخدام أداة المعالجة الدقيقة، حرك حامل الماصة إلى أعلى موضع. بعد ذلك، قم بتحميل الماصة الدقيقة برأس قطره 0.5 ميكرومتر على حامل الماصة.

ثم ارفع المستوى البؤري الموضوعي فوق المستوى A وأعلى الخلية إلى المستوى B عن طريق ضبط التحكم الدقيق. بعد ذلك ، اضبط المعالج الدقيق على موضع التحكم الخشن. قم بخفض الماصة الدقيقة ببطء إلى المستوى B من خلال مراقبة صورة ظلية الماصة الدقيقة حتى يتم التركيز على الماصة الدقيقة بالكامل.

بمجرد أن يصبح طرف الماصة الدقيقة في بؤرة التركيز، اضبط جهاز المعالجة الدقيقة على التحكم الدقيق. بعد ذلك ، قم بخفض الهدف إلى المستوى الاستوائي للخلية وخفض الماصة الدقيقة إلى حوالي 15 ميكرومتر فوق ذلك. اضبط ضغط التعويض على الحاقن الدقيق على الضغط المطلوب.

انتظر عدة ثوان حتى يستقر الضغط. من المهم التحقق مما إذا كان طرف الماصة مكسورا أو مسدودا ، وإلا فإن قياس القوة سيكون غير دقيق. تأكد من عدم انسداد الماصة الدقيقة باستخدام الإعداد النظيف الموجود على لوحة المعالجة الدقيقة وتأكد من خروج فقاعات الهواء من طرف الماصة الدقيقة.

بعد ذلك، أدخل طرف الماصة الدقيقة في الخلية حتى تلامس السطح النووي برفق. قم بإنشاء مانع تسرب بين طرف الماصة الدقيقة والغشاء النووي عن طريق فصل أنبوب إمداد الضغط عن نظام الحقن المجهر، وبالتالي فتح نهاية الماصة الدقيقة في الغلاف الجوي. تخلق هذه الخطوة ضغطا سلبيا يساوي ضغط التعويض على السطح النووي.

بعد ذلك ، افتح برنامج جمع الصور. قم بإعداد اكتساب AVI للفيديو أو اكتساب ND للصور في برنامج جمع الصور. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى قناة التصوير الفلورية المقابلة وابدأ التصوير.

حرك طرف الماصة الدقيقة بعيدا عن جسم الخلية حتى تنفصل النواة عن الماصة الدقيقة. يوضح هذا الشكل تأثير نواة الخلايا الليفية للفأر NIH 3T3. عندما يتحرك طرف الماصة الدقيقة إلى اليمين، تتشوه النواة وتنفصل في النهاية عن طرف الماصة الدقيقة.

ينظر إلى إجهاد طول النواة على أنه يزداد مع زيادة قوة الشفط. تشكل الحافة الأمامية للنواة نتوءا نوويا ويتم إزاحة الحافة الخلفية من موضعها الأصلي. طول النتوء أكبر بكثير من إزاحة الحافة الخلفية ، مما يشير إلى تكامل محكم بين النواة والسيتوبلازم المحيط.

المقاييس الزمنية قصيرة لتخفيف الحافة الأمامية النووية والحافة الخلفية النووية. تم استخدام مسبار القوة المباشرة لتحديد مساهمة الهياكل داخل النواة والهيكل الخلوي في مقاومة النواة للتشوه. أظهرت صور الفلورسنت تراكب النواة قبل وبعد في الحالة المشار إليها.

في حين لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية في التشوه النووي أو الترجمة بعد اضطراب F-actin أو اضطراب الأنابيب الدقيقة ، فإن تقليل التعبير عن المنتين من خلال ضربة قاضية قائمة على siRNA أدى إلى زيادة الترجمة والتشوه النووي بشكل ملحوظ. يشير هذا إلى أن خيوط المنتين الوسيطة في الخلايا الليفية هي العنصر الهيكلي الخلوي الرئيسي الذي ساعد النواة على مقاومة القوة المحلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق قوة خاضعة للرقابة ومعروفة على النواة في خلية ملتصقة حية.