التحليل الجرثومي التعبير الجيني عن طريق ميكروأرس]

مرحبا ، اسمي إينا ونقوم بشكل روتيني بتنميط التعبير الجيني في المختبر. ونستخدم هذه التقنية لمراقبة الجينات المنظمة التفاضلية بين الميثامفيتامين والنوع البري. واليوم لدي عينات من النوع البري وعينات الحمض النووي الريبي من الميثامفيتامين وكلنا نقوم بعمل C أولا.

نحن نستخدم طرق وضع العلامات غير المباشرة وميزة هذه التقنية هي منع تحيز العين الذي يمكن أن يحدث في وضع العلامات المباشرة. وللقيام بذلك ، لدينا عينات من الحمض النووي الريبي ونختار الحصول على ثلاثة ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في 13 ميكرولتر من الحجم الإجمالي. ونضيف 2.5 ميكرو من العشوائي في حدائقنا.

وسنحتضن العينة عند سبع درجات وخمس درجات لتكون طبيعة الحمض النووي الريبي لمدة ثماني دقائق. والآن سنضيف ، سنضيف كوكتيل النسخ العكسي الذي يحتوي على مزيج مستمر من AM L-D-L-D-U-T-P ، ومخزن مؤقت للنسخ العكسي وأيضا ET TT Big it Down واحتضان العينة عند 42 درجة لمدة أربع ساعات. لذلك بعد أربع ساعات نأخذ العينات.

والآن في الأنبوب لدينا مزيج من CDNA و RNA. وما نريد فعله هو أن نفعل الحمض النووي الريبي الهيدروكسي بإضافة هيدروكسيد الصوديوم و EDTA، والتركيز النهائي لهيدروكسيد الصوديوم يجب أن يكون مائة مول. ويجب أن يكون التركيز النهائي ل e BT خمسة ضرس.

والآن سنقوم باحتضان عينات في حمام مائي بدرجة 65 درجة لمدة 10 دقائق. إذن، تتم الحضانة، وسنستغل العينات بإضافة الأس الهيدروجيني سبع أكوام، ماء واحد إلى التركيز النهائي البالغ 500 مولار. في هذه المرحلة ، يمكنك تخزين العينات عند 20 تحت الصفر أو يمكنك متابعة التنظيف.

لتنظيف CDNA ، نستخدم مجموعة تنقية KaiGen PCR. ومع ذلك ، نظرا لأن المخزن المؤقت للأدغال والمخزن المؤقت الأيوني يحتوي على تحرير ، فنحن لا نفعل ذلك ، فنحن نقوم بإعداد المخزن المؤقت لشجيرة المصير ومخزن أيون المصير الخاص بنا وستضيف 300 لتر من PPI وسنقوم بأنابيب تلك البركة ببطء إليك لنقل الخليط إلى أعمدة وستدور لمدة دقيقة واحدة بأعلى سرعة وستشاهد ، المخزن المؤقت الذي أعددناه. مخزن غسيل الفوسفات ، ستضيف 750 ميكرولتر وهكذا ، وستضيف آخر لواحد مرة أخرى.

لذلك سندور مرة أخرى فقط للتأكد من أننا حصلنا على كل السرير. وسنقوم بنقل هذه الأنابيب إلى أنابيب مجرمة فارغة. وسأضيف 30 علامة من فوفوسفات الفوسفات E المخزن المؤقت ، وهي أربعة أربعة مولار من فوسفات البوتاسيوم عند الرقم الهيدروجيني 8.5.

وهنا تحتاج فقط إلى التأكد من إضافة كل شيء إلى وسط العمود وستحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. لذلك سوف تدور لمدة دقيقة واحدة مرة أخرى وسأضيف 30 عازلة صفرية أخرى أقوم باحتضانها أو غرفة نوم. لذلك أزلت العمود ولدينا حجم إجمالي يبلغ 60 ميكرو أو CDA.

بمجرد تنظيف CDNA ، يمكنك تخزينه تحت الصفر 20 درجة ويمكننا أيضا تجفيفه ثم تخزينه حتى نتمكن من تجفيف CDNA في التعليقات. والآن في الأنبوب لدينا CDA جاف ، والذي تم تعديله. وما سنفعله هو أنني سأعلق العينة الجافة.

سأقوم بتعليق العينة في 10 تورات من 15 بيكربونات LAR عند درجة الحموضة تسعة. وسأفعل هذا فقط عن طريق ing صعودا وهبوطا في هذه الخطوة ، من المهم جدا أن يفعل الحمض النووي (cDNA). حسنا ، لشراء رد فعل الشركة على العمل ، يجب أن يحدث رد الفعل هذا في الغرفة المظلمة لأن ملصقات الفلورسنت حساسة للقالب.

ومع ذلك ، فإن اختيار هذه من علوم الحياة وهم ، فقد جاءوا في حزم فردية. يحتوي S five على غطاء أرجواني والجانب الثالث به غطاء برتقالي ويظهر S five أيضا Sion عندما يتم تعليقه ويظهر Cary أرجوانيا. لذا ما سأفعله في الغرفة المظلمة هو أنني سأنقل هذه العينات إلى أنابيب صبغة ، وسأقوم بتعليق الصبغة ونقلها مرة أخرى إلى الأنبوب الذي لدي.

وبعد ذلك سأحتضن في الظلام لمدة ساعتين بعد ساعتين من الحضانة ، وتوقف هذه التفاعل بإضافة 35 مرة من مائة مللي مولار أسيتات الصوديوم عند الرقم الهيدروجيني 5.2. وبعد ذلك قمنا بالتنظيف بإجراء تنظيف مماثل. ومع ذلك ، هذه المرة نستخدم كاجون المخزن المؤقت للغسيل والشطف.

يمكنك وصف الأماكن التي تضع فيها العينة والتي يجب أن تنظف الجهاز. حتى تتمكن من عينتك أو مزيجك الآن I To ، إذن هذه هي عينة Scifi المسماة وهنا ما نراه هو OD اثنين 60 ، والذي يعرض محتوى CDA و OD six 50 ، والذي يوضح دمج D ل scifi. وهنا عينة التسمية الثلاثة من جانبي.

مرة أخرى ، قم بتحريف ستة تركيزات وخمسة 50 مقياسا في موقع الدمج الثالث. نظرا لأن شركة D الخاصة بي تعمل بكفاءة ، سأقوم بدمج العينات الآن ، السيدة تفوتها لفترة وجيزة. والآن سنكتب عينة مرة أخرى باستخدام الملاحظات.

حسنا ، من أجل تشكيل الشريحة ، سنقوم بإعادة الترطيب عن طريق وضع الشريحة عالميا فوق الماء وهذا سيجعل البقع أكبر. وبعد ذلك لحماية ذلك ، سنقوم بتجفيف مائة درجة مئوية وسنقوم بعد ذلك بتهجين الأشعة فوق البنفسجية أو الأشعة فوق البنفسجية التي تربط البقع في الشريحة ثم سنحتضن في المخزن المؤقت المرتفع الذي لدينا. لذلك أضع الشريحة ووجهها لأسفل ، لكنها لم تلمس الماء بعد.

وسننتظر هكذا لمدة خمس دقائق. أنا ، لذلك يبدو هذا الصندوق أكبر ، يجب أن يكون أكثر لمعانا مما كان عليه قبل وضعه ، وسوف تجف فقط عن طريق وضع الشريحة على مائة درجة وستلاحظ التكثيف. وسنقوم بالارتباط معك.

لذلك من أجل الترطيب ، سأغمس الشريحة في مياه ما قبل الحرب. ويجب أن يكون هذا سريعا حقا لأن الهدف هنا هو أنك تريد التخلص من جميع البقع أو جميع oligos الموجودة على الفور غير مرتبطة. وإذا كنت تسير ببطء في هذه العملية ، فستحصل فقط على ذيول في مواقعك.

لذا تأكد فقط من أنك تفعل ذلك بسرعة وتأكد من أنك لا تأخذ رحلتك من الماء وتفعل هذه الأشياء لمدة 30 ثانية وقم بتمريرها على الفور في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق و 700 دقيقة في الهواء احصل على هذا ، نحن نضع هذه الشريحة في المخزن المؤقت لمحطة الأنابيب قبل الحرب التي كانت لدينا وندفع الشريحة ببطء إلى الجرة وسنقوم باحتضان هذا عند 42 درجة في 45 دقيقة على الأقل. إذن لدينا هنا عينتنا المجففة ليتم تهجينها. لذلك سنقوم أولا بتعليق Resus في الماء.

في هذه الخطوة ، نقوم فقط بتعليق الإعادة من خلال الحدوث صعودا وهبوطا وربما لا نكشف العينة عن الأبيض والأبيض جدا. وبعد ذلك ستضيف الحمض النووي للحيوانات المنوية لشخص ما 1.5 والتركيز 10 ملليغرام لكل مل. وستضيف 1.2 مسوق من TRNA.

التركيز 12.5 ملليغرام لكل ، نضيف الحمض النووي الريبي والحمض النووي للحيوانات المنوية لمنع المائي غير المحدد. ونضيف 5.35 علامة صفر ثلاثة XSSC، وهو ما يعطى التركيز النهائي يساوي ثلاثة x. وأخيرا نضيف 3.5 ميكرولتر من 1٪ SDS.

الآن سنغلي الخليط لمدة خمس دقائق وسندور بأعلى سرعة لمدة خمس دقائق وسيكون جاهزا لتناول ذلك. لقد مرت ساعة منذ أن احتضنا شريحتنا والآن لدي ماء وأيزوبروبانول. لذلك سأقوم بتحريك الشريحة في الماء أولا للتخلص من SDS ثم غسل البروبانول dza ووضعه مباشرة في المقياس القياسي.

وهنا ، فقط كن حذرا من عدم تعريض الضوء كثيرا للهواء لمنع الجفاف. لذلك أذهب مباشرة من المخزن المؤقت لمحطة الضرر إلى الماء ونقوم بغسل الشريحة. بضع دقائق ، فقط تأكد من أن الحركة صعودا وهبوطا فقط ، وليست جانبية.

وتأكد أيضا من أن الشريحة ليست فوق الماء وسنقوم بنقلها إلى الأيزوبروبانول على الفور. ويبقى هنا لبضع دقائق مرة أخرى. وهل يمكن لصفحتك يرجى الإجابة على صفحتك في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق؟

700 R.Cool. لذا فإن شريحتنا جاهزة أيضا للتهجين ومن الأفضل الاحتفاظ بها في صندوق منزلق لحمايتها من الحافلة. لذلك بالنسبة لمحطة الحصاد ، سنستخدم الرفع أو الانزلاق.

توجد شرائط بيضاء على زلة الغطاء وستوفر بعض الرفع وستوفر بعض المساحة لعينتنا للدخول بين زلة الغطاء والشريحة. وأنا أنظفه بالإيثانول ثم وضع الأسلاك وتأكد فقط من عدم وجود جسيم اختبار. لذلك سنأخذ أولا شريحة القالب الخاصة بنا التي تم وضع علامة عليها في منطقة الطباعة ، وفوقها سنضع الشريحة التي أعددناها ونتأكد من محاذاتها بشكل مثالي.

تأكد من محاذاة الماكن. وتحتاج إلى التأكد من أن الشرائط على الجانب ، وأننا سنواجهها لأسفل. لذلك من الصعب حقا رؤيته، ولكن تأكد من أنه يمكنك رؤيته.

ويجب أن تكون الخطوط على جانبي الشرائح. وسنقوم بتحميل العينة من الجانبين. آخذ كميات صغيرة من العينة ، لذلك آخذ 15 ميكرولترا أولا وأبدأ في التحميل من الزاوية قبالة زلة الغطاء.

وببطء كنت أسحبه للداخل وأتحرك على طول الحافة لتغطية كل المنطقة. في هذه المرحلة ، من المهم جدا عدم إدخال أي فقاعات وآخذ 15 مهاجرا آخر وأضعها على جانب الشرائح لمنع أي جفاف. لذا فإن عينتنا جاهزة وستحتضن الشرائح وغرف تحديد الأولويات ، والتي تحتوي على قنوات صغيرة لترطيب الشريحة أثناء تهجينها.

وسنضيف 10 مسوق من ثلاثة XSSC في ست زوايا من الشريحة. كانت هناك ستة أماكن في الغرفة ، آسف ، في كل زاوية أنا ، وعلى كل جانب ، تأكد من نقل الشريحة برفق حتى لا تنزلق زلة الغطاء. وعندما تضع الشريحة على الجانب الأيمن لأعلى ، سترى أنها ستتراكم ، وستلتصق بالماء الذي تضعه وتضع الغطاء وتأكد من أن البراغي ضيقة.

سنقوم باحتضان غرفة المحادثة في كيس ماء 65 درجة ، لكننا لا نريد وضعها مباشرة في الأسفل. لذلك وضعنا نوعا من الحاجز البلاستيكي لمنع انتقال الحرارة الزائدة. ونضع غرفة التزييف الخاصة بنا برفق ولمنع أي إزاحة ، يمكنك أيضا وضع نوع من الوزن.

وستستمر هذه الحضانة بين عشية وضحاها ، عادة ما بين 10 إلى 12 ساعة. لذلك لغسل الشريحة ، نستخدم XSSC واحد مع 0.05 في المائة SDS. سيكون هذا لإزالة زلة الغطاء.

وسيكون هذا لغسل الخطوة الأولى. وسنقوم بخطوتين أخريين فقط مع 0.06٪ ستة XSC من خلال جميع SDS التي لدينا. لذلك نحن جميعا نفسد المحادثة ونأخذ الشرائح ونضعها ووجهها لأسفل في حاوية محفظة.

وسنقوم فقط بهزها جنبا إلى جنب وسنرى أن زلة الغطاء ستسقط برفق. حسنا ، وسننقل فقط إلى مخزن غسيل آخر يحتوي على XES. أنت تأكل لمدة دقيقة واحدة.

انتقل إلى الذهاب إلى ستة XSSC. وفقط للتأكد من أننا تخلصنا من جميع FDS ، سنكررها مرة أخرى. كان جهاز الطرد المركزي حتى يجف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق عند 700 RP. يمكنك الاحتفاظ بهذه الشريحة في مربع الشرائح لأنها حساسة للضوء.

إذن هذا هو الماسح الضوئي للشرائح وستقوم بوضع الشريحة هنا ، مساحة صغيرة هنا ، ضع الشريحة ووجهها لأسفل ، وتسمى باتجاه و ، وفي الشريحة الثانية ، ستحدد فقط المنطقة التي تريد مسحها ضوئيا. وستأخذ هذه المنطقة في شرائحنا. لدينا ، نستخدم 16 دبوسا لطباعة شرائحنا.

لذلك تتوافق كل كتلة مع دبوس واحد وتحتوي شرائحنا على أكثر من 8000 نقطة. ونحن نمثل جينوم اللون السادس مرتين لأنه حوالي 4000 جين. إذن، لدينا نقطتان لكل أوليغو نستخدده.

وإذا تم تكبيرها ، سترون في هذه التجربة بالذات ، فإننا نقارن طفرات منظم النسخ بالنوع البري ، وسيتم تصنيف الطفرة ب sifi ، مما يعطي اللون الأحمر. وكان النوع البري هو الموقع الثالث ، والذي يعطي اللون الأخضر. لذا فإن أي شيء يبدو أحمر ، مثل هذه البقع ، يشير إلى أن وفرة النصوص في الطفرة كانت أعلى من النوع البري.

لذلك تظهر باللون الأحمر أو ظلال من اللون الأحمر ، وأي شيء قد يظهر باللون الأخضر يشير إلى أن وفرة النص كانت أعلى في النوع البري مقارنة بالطفرة. وأي بقعة تظهر باللون الأصفر تشير إلى أن هذا النص كان موجودا بشكل متساو في كل من النوع المتحور والبري. لذلك عندما تتراكب ، فإنها ستظهر صفراء مثل هذه اللكن.