خلية واحدة Electroporation عبر مختلف الثقافة شريحة Organotypic من الإثارة فرس النهر الماوس والخلايا العصبية المثبطة فئة محددة

يقدم هنا بروتوكول للكهرومporation أحادي الخلية التي يمكن أن توفر الجينات في كل من الخلايا العصبية مثير ومثبطة عبر مجموعة من الأعمار ثقافة شريحة فرس النهر في المختبر. يوفر نهجنا تعبيرا دقيقا وفعالا عن الجينات في الخلايا الفردية ، والتي يمكن استخدامها لفحص الوظائف المستقلة للخلايا وبين الخلايا.

تعداء الجينات نهجا حيويا لدراسات علم الأعصاب. تمكننا تقنية التثقيب الكهربائي لدينا من نقل الخلايا العصبية الداخلية للجينات ذات الأهمية في ثقافة شرائح الحصين العضوية دون أي آثار جانبية يمكن اكتشافها. يتمتع هذا البروتوكول بكفاءة تعداء أعلى بكثير مقارنة ببروتوكولات الخلية المفردة الأخرى ، لكنه لا يزال غير مكلف نسبيا وسهل التنفيذ.

ستكون هذه التقنية مفيدة للباحثين المهتمين بفهم الوظائف الجزيئية والفسيولوجية المحددة للخلايا العصبية ، بما في ذلك آليات استقلالية الخلية وتفاعلات البروتين عبر المشبكي. لتحضير مزارع الشرائح للتثقيب الكهربائي ، انقل إدخالات الثقافة ذات الأهمية إلى أطباق بتري فردية بحجم ثلاثة سنتيمترات محملة ب 900 ميكرولتر من وسط الاستزراع ، وضع الثقافات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون على الطاولة. بعد ذلك ، قم باحتضان إدخالات الثقافة الطازجة مسبقا باستخدام مليلتر واحد من وسط زراعة الشرائح لكل إدراج في طبق بتري بطول 3.5 سم لمدة 30 دقيقة على الأقل ، وقم بتعقيم خطوط جهاز التثقيب الكهربائي باستخدام 10٪ مبيض لمدة خمس دقائق.

في نهاية التروية ، اشطف الخطوط بالماء المعقمة المتأين لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الترشيح باستخدام ACSF المعقم بالترشيح الذي يحتوي على 0.001 مللي مولار من رباعي السموف. اضبط نبضة المثق الكهربائي على سعة سالب خمسة فولت، ونبضة مربعة، وقطار 500 مللي ثانية، وتردد 50 هرتز، وعرض نبضة 500 ميكروثانية. املأ ماصة زجاجية بخمسة ميكرولترات من المحلول الداخلي المحتوي على البلازميد، وقم بنقر الطرف برفق واضغط عليه عدة مرات لإزالة أي فقاعات محاصرة.

استخدم مجهر التشريح للتأكد من عدم تلف الطرف ، وقم بتوصيل طرف الماصة بإحكام بالقطب. عندما يتلامس الطرف مع ACSF، قم بتسجيل قراءة مقاومة الماصة للمثقب الكهربائي. لعزل ثقافة الشريحة ، قم بقص غشاء إدخال المزرعة بشفرة حادة ، واستخدم ملقطا حادا بزاوية لنقل ثقافة الشريحة بعناية إلى غرفة التثقيب الكهربائي.

ثم قم بإصلاح موضع الثقافة باستخدام مرساة شريحة. للتثقيب الكهربائي للخلايا ذات الأهمية، قم بالضغط الإيجابي على الماصة عن طريق الفم، واستخدم أدوات التحكم في المقبض ثلاثي الأبعاد لمناورة طرف الماصة بالقرب من سطح ثقافة الشرائح. عند عرض الثقافة بالمجهر ، اقترب من الخلية المستهدفة بالحافة ، مع الحفاظ على الضغط الإيجابي المطبق حتى تتشكل غمازة على سطح الخلية.

عند تصور الدمل ، قم بتطبيق ضغط سلبي خفيف بسرعة عن طريق الفم بحيث يتشكل ختم فضفاض بين طرف الماصة وغشاء البلازما. سوف يدخل الغشاء قليلا إلى الماصة. يجب ملاحظة زيادة بمقدار 2.5 مرة تقريبا في المقاومة الأولية للماصة، كما يتضح من زيادة النغمة من مكبرات الصوت.

أعد تطبيق الضغط الإيجابي بسرعة حتى يتم إصلاح الدمل. ثم أكمل على الفور دورتين أخريين على الأقل من الضغط كما هو موضح للتو دون توقف. بعد نبضة الضغط الأخيرة ، استمر في الضغط السلبي لمدة ثانية واحدة.

عندما تصل النغمة من مكبرات الصوت إلى قمة ثابتة في درجة الصوت ، استخدم دواسة القدم لنبض المثقوب الكهربائي بسرعة. بعد التثقيب الكهربائي ، اسحب الماصة برفق حوالي 100 ميكرون من الخلية دون الضغط ، وأعد الضغط الإيجابي ، وتحقق من أن المقاومة مشابهة لقراءة خط الأساس قبل الاقتراب من الخلية التالية. عندما يتم إجراء مثقات كهربائية لجميع الخلايا ذات الأهمية ، انقل مزرعة الشرائح إلى أحد إدخالات الثقافة الطازجة المحضرة ، وضع الملحق عند 35 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام.

في هذه التجربة التمثيلية ، تم تحويل EGFP إلى خمسة إلى 20 خلية عصبية هرمية في منطقة الحصين CA1 عبر سبعة و 14 و 21 يوما في أعمار زراعة الشرائح المختبرية. يمكن أيضا أن تكون الخلايا العصبية الداخلية من النوع 3 من البارفألبومين والغلوتامات الحويصلية من النوع 3 بالكهرباء بنجاح داخل منطقة الحصين CA1. ومن المثير للاهتمام ، أن التعدي لا يتأثر بشكل كبير بعمر ثقافة الشرائح في المختبر ، ولا يختلف مع كفاءة التعدي التي لوحظت في الخلايا العصبية الهرمية CA1.

الخلايا العصبية هشة للغاية. يجب أن تكون حذرا ولطيفا للغاية عند الاقتراب من الخلايا والضغط على تدوير الخلايا وسحب طرف الماصة لإحداث أضرار جسيمة. بعد التثقيب الكهربائي ، يمكن أن تخضع الخلايا لتحليلات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير.