خلية واحدة Electroporation عبر مختلف الثقافة شريحة Organotypic من الإثارة فرس النهر الماوس والخلايا العصبية المثبطة فئة محددة
أكتوبر 6, 2020
يقدم هنا بروتوكول للكهرومporation أحادي الخلية التي يمكن أن توفر الجينات في كل من الخلايا العصبية مثير ومثبطة عبر مجموعة من الأعمار ثقافة شريحة فرس النهر في المختبر. يوفر نهجنا تعبيرا دقيقا وفعالا عن الجينات في الخلايا الفردية ، والتي يمكن استخدامها لفحص الوظائف المستقلة للخلايا وبين الخلايا.
تعداء الجينات نهجا حيويا لدراسات علم الأعصاب. تمكننا تقنية التثقيب الكهربائي لدينا من نقل الخلايا العصبية الداخلية للجينات ذات الأهمية في ثقافة شرائح الحصين العضوية دون أي آثار جانبية يمكن اكتشافها. يتمتع هذا البروتوكول بكفاءة تعداء أعلى بكثير مقارنة ببروتوكولات الخلية المفردة الأخرى ، لكنه لا يزال غير مكلف نسبيا وسهل التنفيذ.
ستكون هذه التقنية مفيدة للباحثين المهتمين بفهم الوظائف الجزيئية والفسيولوجية المحددة للخلايا العصبية ، بما في ذلك آليات استقلالية الخلية وتفاعلات البروتين عبر المشبكي. لتحضير مزارع الشرائح للتثقيب الكهربائي ، انقل إدخالات الثقافة ذات الأهمية إلى أطباق بتري فردية بحجم ثلاثة سنتيمترات محملة ب 900 ميكرولتر من وسط الاستزراع ، وضع الثقافات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون على الطاولة. بعد ذلك ، قم باحتضان إدخالات الثقافة الطازجة مسبقا باستخدام مليلتر واحد من وسط زراعة الشرائح لكل إدراج في طبق بتري بطول 3.5 سم لمدة 30 دقيقة على الأقل ، وقم بتعقيم خطوط جهاز التثقيب الكهربائي باستخدام 10٪ مبيض لمدة خمس دقائق.
في نهاية التروية ، اشطف الخطوط بالماء المعقمة المتأين لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الترشيح باستخدام ACSF المعقم بالترشيح الذي يحتوي على 0.001 مللي مولار من رباعي السموف. اضبط نبضة المثق الكهربائي على سعة سالب خمسة فولت، ونبضة مربعة، وقطار 500 مللي ثانية، وتردد 50 هرتز، وعرض نبضة 500 ميكروثانية. املأ ماصة زجاجية بخمسة ميكرولترات من المحلول الداخلي المحتوي على البلازميد، وقم بنقر الطرف برفق واضغط عليه عدة مرات لإزالة أي فقاعات محاصرة.
استخدم مجهر التشريح للتأكد من عدم تلف الطرف ، وقم بتوصيل طرف الماصة بإحكام بالقطب. عندما يتلامس الطرف مع ACSF، قم بتسجيل قراءة مقاومة الماصة للمثقب الكهربائي. لعزل ثقافة الشريحة ، قم بقص غشاء إدخال المزرعة بشفرة حادة ، واستخدم ملقطا حادا بزاوية لنقل ثقافة الشريحة بعناية إلى غرفة التثقيب الكهربائي.
ثم قم بإصلاح موضع الثقافة باستخدام مرساة شريحة. للتثقيب الكهربائي للخلايا ذات الأهمية، قم بالضغط الإيجابي على الماصة عن طريق الفم، واستخدم أدوات التحكم في المقبض ثلاثي الأبعاد لمناورة طرف الماصة بالقرب من سطح ثقافة الشرائح. عند عرض الثقافة بالمجهر ، اقترب من الخلية المستهدفة بالحافة ، مع الحفاظ على الضغط الإيجابي المطبق حتى تتشكل غمازة على سطح الخلية.
عند تصور الدمل ، قم بتطبيق ضغط سلبي خفيف بسرعة عن طريق الفم بحيث يتشكل ختم فضفاض بين طرف الماصة وغشاء البلازما. سوف يدخل الغشاء قليلا إلى الماصة. يجب ملاحظة زيادة بمقدار 2.5 مرة تقريبا في المقاومة الأولية للماصة، كما يتضح من زيادة النغمة من مكبرات الصوت.
أعد تطبيق الضغط الإيجابي بسرعة حتى يتم إصلاح الدمل. ثم أكمل على الفور دورتين أخريين على الأقل من الضغط كما هو موضح للتو دون توقف. بعد نبضة الضغط الأخيرة ، استمر في الضغط السلبي لمدة ثانية واحدة.
عندما تصل النغمة من مكبرات الصوت إلى قمة ثابتة في درجة الصوت ، استخدم دواسة القدم لنبض المثقوب الكهربائي بسرعة. بعد التثقيب الكهربائي ، اسحب الماصة برفق حوالي 100 ميكرون من الخلية دون الضغط ، وأعد الضغط الإيجابي ، وتحقق من أن المقاومة مشابهة لقراءة خط الأساس قبل الاقتراب من الخلية التالية. عندما يتم إجراء مثقات كهربائية لجميع الخلايا ذات الأهمية ، انقل مزرعة الشرائح إلى أحد إدخالات الثقافة الطازجة المحضرة ، وضع الملحق عند 35 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام.
في هذه التجربة التمثيلية ، تم تحويل EGFP إلى خمسة إلى 20 خلية عصبية هرمية في منطقة الحصين CA1 عبر سبعة و 14 و 21 يوما في أعمار زراعة الشرائح المختبرية. يمكن أيضا أن تكون الخلايا العصبية الداخلية من النوع 3 من البارفألبومين والغلوتامات الحويصلية من النوع 3 بالكهرباء بنجاح داخل منطقة الحصين CA1. ومن المثير للاهتمام ، أن التعدي لا يتأثر بشكل كبير بعمر ثقافة الشرائح في المختبر ، ولا يختلف مع كفاءة التعدي التي لوحظت في الخلايا العصبية الهرمية CA1.
الخلايا العصبية هشة للغاية. يجب أن تكون حذرا ولطيفا للغاية عند الاقتراب من الخلايا والضغط على تدوير الخلايا وسحب طرف الماصة لإحداث أضرار جسيمة. بعد التثقيب الكهربائي ، يمكن أن تخضع الخلايا لتحليلات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً للتثقيب الكهربائي للخلايا المفردة، والذي يتيح نقل الجينات إلى كل من العصبونات الاستثارة والمثبطة في مستنبتات شرائح الحصين ذات التنظيم العضوي. وتسمح هذه التقنية بالتحكم الدقيق في التعبير الجيني، مما يسهل دراسة كل من الآليات ذاتية الخلية والتفاعلات بين الخلايا عبر مراحل نمائية مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- نقل الجينات
- الفيزيولوجيا الكهربائية
خلفية علمية
- يعد نقل الجينات أمراً بالغ الأهمية في أبحاث البيولوجيا العصبية.
- يوفر التثقيب الكهربائي كفاءة نقل عالية مع حد أدنى من الآثار الجانبية.
- تعتبر هذه الطريقة بسيطة وغير مكلفة نسبياً مقارنة بالتقنيات الأخرى.
- إن فهم الوظائف الجزيئية والفسيولوجية في الخلايا العصبية ضروري لعلم البيولوجيا العصبية.
الغرض من الدراسة
- تأسيس طريقة فعالة لنقل الجينات في المجموعات العصبونية.
- دراسة وظائف وآليات جزيئية محددة في كل من العصبونات الاستثارة والمثبطة.
- تقييم كفاءة نقل الجينات عبر أعمار مختلفة من مستنبتات الشرائح.
الطرق المستخدمة
- تم إجراء عملية التثقيب الكهربائي على مستنبتات شرائح الحصين ذات النمط العضوي.
- كانت العصبونات الهرمية والعصبونات البينية هي النماذج البيولوجية الرئيسية المستخدمة.
- تم تقييم كفاءة عفن التحول عبر شرائح من أعمار مختلفة (7 و14 و21 يوماً في المختبر).
- تتضمن الخطوات التفصيلية التحضير، وتقنيات السحب بالمصّة، ومراقبة تغيرات المقاومة.
- تم تقليل الإصابات الخلوية أثناء العملية من خلال التعامل الدقيق.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق كفاءة عالية في نقل الجينات إلى الخلايا العصبية المستهدفة دون وجود فروق ذات دلالة إحصائية عبر أعمار مزارع الشرائح.
- لم يؤثر التثقيب الكهربائي سلبًا على الحيوية، مما حافظ على السلامة الخلوية بعد عملية النقل.
- مكنت هذه الطريقة من إجراء دراسات تفصيلية حول الاستجابات الفسيولوجية وآليات التفاعل المحتملة بين الخلايا العصبية.
- كما تم إثبات نجاح نقل الجينات إلى الخلايا العصبية البينية من نوع pars وvesicular glutamate type 3.
الاستنتاجات
- تستعرض هذه الدراسة بروتوكولاً قوياً لنقل الجينات في المزارع العصبية، مما يعزز القدرات البحثية في علم الأحياء العصبي.
- تضع هذه الطريقة الأساس لمزيد من الاستقصاءات حول الآليات العصبية والوظائف البينية للخلايا.
- يعد فهم هذه العمليات أمراً حيوياً لاكتساب رؤى حول اللدونة العصبية والتطبيقات العلاجية المحتملة.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يُتيح التثقيب الكهربائي للخلايا المفردة في مستنبتات شرائح الحصين ذات البنية العضوية توصيلاً دقيقاً للجينات في العصبونات الاستثارة والمثبطة، مما يدعم عملية التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في اكتشافات العلوم العصبية. توفر هذه الطريقة كفاءة نسخ عالية (~80%) عبر مختلف المراحل النمائية، مما يسمح بإجراء فحص نمطي متسق وتطوير مقايسات لاستقصاء المسارات. يقلل هذا النهج من عدم اليقين البيولوجي في اختبارات فرضيات الأهداف المبكرة من خلال تمكين دراسات تعبير جيني كمية وقابلة للتكرار في أنظمة عصبونية ذات صلة بالأمراض.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية في العصبونات الاستثارية والعصبونات المثبطة النوعية في الحصين.
- القيمة العلمية: يدعم التحقق من الأهداف الوظيفية من خلال ربط التعبير الجيني بالقراءات الفسيولوجية في الدوائر الدقيقة السليمة.
- القيمة التشغيلية: يحقق كفاءة عالية في عفن الخلايا دون آثار جانبية ملحوظة، مما يقلل من التباين التجريبي.
- القيمة التشغيلية: يعمل عبر مختلف أعمار مستنبتات الشرائح (7–21 يوماً in vitro)، مما يسمح بإجراء دراسات المخطط الزمني لارتباط الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة عصبونية تم التحقق من صحتها لإجراء فحوصات التصوير والفيزيولوجيا الكهربائية اللاحقة.
- القيمة العلمية: تقديم بيانات كمية بدقة الخلية الواحدة حول وظائف الجينات والتفاعلات البروتينية.
- القيمة التشغيلية: استخدام معدات الفيزيولوجيا الكهربائية القياسية، مما يتيح التكامل القابل للتوسع في سير العمل الحالي.
- القيمة التشغيلية: الحفاظ على كفاءة عفن الخلية (transfection) على مدى فترات استزراع ممتدة، مما يدعم حملات الفحص الطولية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يوفر دوائر حصينية ذات صلة بالمرض لدراسة آليات الاستهداف في سياقات فيزيولوجية مرضية.
- القيمة العلمية: يتيح تقييم التفاعلات البروتينية عبر المشابك العصبية والآليات المستقلة خلوياً.
- القيمة التشغيلية: يسهل الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من خلال الحفاظ على صحة الخلايا العصبية بعد عملية عفن التعداء.
- القيمة التشغيلية: يدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال توصيل جيني موثوق وقابل للتكرار في مستنبتات عصبية أولية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضية الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الواعدة، مما يتيح تقليل المخاطر الميكانيكية قبل إجراء فحص المركبات.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات في المجموعات العصبونية في الحصين.
- الفحص: توفر أنظمة جاهزة للمقايسة مع ترصيف (transfection) قابل للتكرار ومخرجات كمية لتقييم المركبات.
- التحليلات: تتيح المراقبة القائمة على المقاومة والقراءات الفيزيولوجية الكهربائية لربط التعبير الجيني بالأنماط الظاهرية الوظيفية.
- الأبحاث traslational: تربط دراسات وظائف الجينات بالاستمرارية قبل السريرية عبر الترصيف (transfection) المستقر في شرائح نموذجية للأعضاء.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تستفيد من البنية التحتية القائمة للفيزيولوجيا الكهربائية، مما يجعل هذه الطريقة منصة قابلة لإعادة الاستخدام للتحقق من الأهداف العصبونية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال توصيل الجينات بكفاءة عالية وسمية منخفضة في العصبونات الأولية.
- القيمة التشغيلية: تحقيق التقييس وقابلية التكرار عبر معاملات نبضية ثابتة وبروتوكول دورة ضغط منتظم.
- القيمة الاستراتيجية: اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في ارتباط الهدف العصبي.
- التأثير على المحفظة: ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال التقييم الموثوق لوظيفة الجينات عبر الفئات العصبونية والمراحل التنموية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الفيزيولوجيا الكهربائية والتعامل مع الماصات الدقيقة لاستهداف الخلايا المفردة.
- يعتمد على الأقطاب الزجاجية، وجهاز التثقيب الكهربائي، ومحلول ACSF المعقم مع tetrodotoxin للحفاظ على صحة الخلايا العصبية.
- يستلزم توحيد تسلسلات نبضات الضغط ومراقبة المقاومة بين المستخدمين.
- تشمل اعتبارات التكييف ضبط تركيز البلازميد وعرض النبضة لأنواع الخلايا العصبية المختلفة أو أحجام الجينات المختلفة.
- قيد عملي: تتطلب هشاشة الخلايا العصبية تقنية دقيقة لتجنب تمزق الغشاء أثناء دورات الضغط.
