تطوير التصوير عالي الدقة لتجميعات الفيروسات في السائل والجليد

هنا يتم وصف البروتوكولات لإعداد مجموعات الفيروسات المناسبة لتحليل السائل EM و cryo-EM على المستوى النانوي باستخدام المجهر الإلكتروني المرسل.

ارتفع الاهتمام بالمجهر الإلكتروني السائل في السنوات الأخيرة حيث يمكننا الآن تصور عمليات الوقت الحقيقي على نطاق النانو. يمكن أن تساعدنا المعرفة المحسنة بهذه الهياكل المرنة في تطوير كواشف جديدة لمكافحة مسببات الأمراض الناشئة مثل SARS-CoV-2. تساعد مشاهدة البروتينات في بيئة سائلة على محاكاة الأنظمة الحيوية وتعطينا فرصة للنظر إلى البروتينات بطريقة أكثر ديناميكية.

وستوضح لك هذه التجربة تقنيات جديدة حول كيفية استخدام البروتينات وتصورها في كل من الجليد الزجاجي والبيئات السائلة. تتضمن النتائج الحديثة رؤى ديناميكية للقاحات المرشحة في العلاجات القائمة على الأجسام المضادة المصورة في سائل. تعمل تطبيقات السائل والتبريد الكهرومغناطيسي المترابطة على تعزيز قدرتنا على تصور الديناميات الجزيئية ، مما يوفر سياقا فريدا لصحة الإنسان والمرض.

قد يفكر القراء الذين يستخدمون تقنيات TEM أو cryo-EM التقليدية في تنفيذ تدفقات عمل EM السائلة لتقديم ملاحظات ديناميكية جديدة لعيناتهم بطريقة تكمل استراتيجياتهم الحالية. يمكن أن توفر أنظمة Liquid-EM المتاحة تجاريا التدفق والخلط والمحفزات الكهروكيميائية والتحكم في درجة الحرارة ، والتي تعتبر ضرورية للعديد من تطبيقات التصوير في الوقت الفعلي. تصف طريقة شطيرة الرقاقة الدقيقة المعروضة هنا طريقة بسيطة لمستوى الدخول لعرض العينات أولا في السائل قبل القفز إلى نظام تجاري أكثر تعقيدا للتجارب في الموقع.

للبدء ، قم بتنظيف رقائق نيتريد السيليكون الدقيقة عن طريق احتضان كل شريحة في 150 ملليلتر من الأسيتون لمدة دقيقتين ، تليها الحضانة في 150 ملليلتر من الميثانول لمدة دقيقتين. اترك الرقائق تجف في تدفق الهواء الرقائقي. تقوم البلازما بتنظيف الرقائق المجففة باستخدام أداة تفريغ توهج تعمل في ظل ظروف قياسية لمدة 45 ثانية باستخدام غاز الأرجون.

بعد ذلك ، قم بتحميل رقاقة قاعدة جافة في طرف حامل العينة وأضف حوالي 0.2 ميكرولتر من العينة إلى الشريحة الأساسية. بعد الحضانة لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، ضع الشريحة العلوية على شريحة القاعدة الرطبة التي تحتوي على العينة. قم بزرع المجموعة معا لتشكيل حاوية محكمة الغلق مثبتة في مكانها ميكانيكيا بواسطة ثلاثة براغي نحاسية.

ضخ الطرف إلى 10 إلى ناقص ستة تور باستخدام محطة ضخ جافة يتم ضخها بالتوربو. الحامل جاهز الآن لإدخاله في TEM. تقوم البلازما بتنظيف الرقائق الدقيقة وشبكات الكربون باستخدام أداة تفريغ التوهج لمدة 45 ثانية.

وأضف حوالي ميكرولتر من العينة إلى رقاقة متوهجة مفرغة موضوعة على عبوة هلام. قم بإزالة المحلول الزائد باستخدام ورق الترشيح أو ماصة واحتضانه لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ثم أضف شبكة الكربون المفرغة المتوهجة إلى الرقاقة الدقيقة الرطبة التي تحتوي على العينة.

ازرع المجموعة معا باستخدام حامل عينة إمالة واحد في درجة حرارة الغرفة لتشكيل حاوية محكمة الغلق. بدلا من ذلك ، استخدم مقاطع شبكة التحميل التلقائي وضع مجموعة الساندويتش على مشبك C السفلي. ضع المشبك العلوي أعلى المجموعة واستخدم أداة التثبيت القياسية لإغلاق التجميع معا.

العينة جاهزة الآن لإدخالها في TEM. افحص العينات الموضوعة في اللوادر التلقائية تحت ظروف التبريد أو في درجة حرارة الغرفة. للتصوير السائل EM ، قم بتحميل حامل العينة في TEM المجهز بمسدس انبعاث ميداني ويعمل عند 200 كيلوفولت.

قم بتشغيل البندقية واضبط الارتفاع المركزي لمرحلة المجهر فيما يتعلق بالعينة باستخدام وظيفة المتذبذب ، وإمالة العينة من 15 درجة تحت الصفر إلى 15 درجة زائد في العمود. يضبط هذا الإجراء المرحلة في الاتجاه Z لاستيعاب سمك العينة ويساعد على ضمان التكبير الدقيق أثناء تسجيل الصورة. سجل الصور كأفلام طويلة أو صور فردية باستخدام حزمة برامج جمع البيانات التسلسلية ، وتنفيذ إجراءات التصوير الآلي.

التقط صورا في ظل ظروف جرعة منخفضة بتكبير يتراوح من 28،000X إلى 92،000X و 40 إطارا في الثانية. اضبط أوقات التعرض لتقليل تلف الحزمة للعينة واستخدم نطاق إلغاء التركيز البؤري من ناقص واحد إلى أربعة ميكرومتر عند التكبير المحدد. في حالة مواجهة حل سميك، استخدم قيم إلغاء تركيز بؤري أعلى أو حدد منطقة اهتمام مختلفة.

تأكد من وجود المحلول في العينات طوال جلسة التصوير عن طريق تركيز شعاع الإلكترون على منطقة قربانية لا تستخدم لجمع البيانات حتى تتشكل الفقاعات. قم بتحليل الأفلام بحثا عن جزيئات SARS-CoV-2 باستخدام برنامج RELION-3.0.8 أو أي برنامج آخر لمعالجة الصور. قم بإجراء تصحيح الحركة باستخدام برنامج MotionCor2.

بمجرد التصحيح ، استخرج الجسيمات باستخدام أداة الانتقاء التلقائي في حزمة برامج البرنامج. أحجام الصناديق النموذجية هي 330 بكسل للعينات السائلة و 350 بكسل لعينات الجليد. احسب عمليات إعادة البناء الأولية باستخدام تناظر C1 مع روتين النموذج الأولي ثلاثي الأبعاد للبرنامج وخيارات نموذج ab initio في حزمة برامج معالجة البيانات.

ثم قم بإجراء بروتوكولات التحسين في برنامج معالجة البيانات. افحص النتائج باستخدام حزمة برامج تحليل التركيب الجزيئي أثناء تقييم التغييرات الديناميكية. تظهر هنا مقارنة بين هياكل السائل الكهرومغناطيسي و cryo-EM في النوع الفرعي الثالث من الفيروس المرتبط بالغدي أو AAV.

تظهر الصور التمثيلية بنية AAV في المحلول وفي الجليد. تظهر هنا المناظر الدورانية للوحدة الفرعية AAV VP1 المستخرجة من الهياكل السائلة والجليدية. تمثل هذه الصور القيم الديناميكية في الهياكل السائلة التي تم إنشاؤها باستخدام وظيفة خريطة morph في برنامج تحليل البنية الجزيئية.

تظهر الهياكل المتوسطة من تجميعات الفيروسات المتعددة تغيرات توافقية مع تغير قطري بنسبة 5٪ تقريبا تم قياسه باستخدام بيانات EM. تظهر هنا صورة لتجميعات تحت فيروسية SARS-CoV-2 معزولة من أجزاء المصل من مرضى COVID-19. تشير هذه الفقاعات البيضاء إلى وجود سائل في العينة.

تظهر هنا إعادة بناء EM لهذه التجميعات دون الفيروسية بكثافات شعاعية ملونة عند خمس شرائح نانومتر عبر الخريطة. تصف الصورة التمثيلية تحليل جزيئات فيروس الروتا مزدوجة الطبقات المحضرة في الثلج الزجاجي باستخدام تقنية شطيرة الرقاقة. يجب التقليل من استخدام المنظفات والجلسرين والبولي إيثيلين والجليكول والمستويات العالية من السكريات أو تجنبها للتصوير السائل الكهرومغناطيسي.

قد تدخل هذه الكواشف القطع الأثرية ، وتخلق فقاعات مفرطة ، ومنتجات التحلل المائي ، والجذور الحرة بسبب تلف الحزمة. سيسمح استخدام هذه البروتوكولات للعلماء بأن يكونوا قادرين على دراسة العمليات الديناميكية بالتفاصيل الذرية. وهذا يمتد عبر مجالات متعددة من العلوم بما في ذلك الطب وعلوم الحياة وأبحاث المواد.

تصف البروتوكولات المعروضة هنا كيف يمكن للأدوات الحديثة أن توفر وسيلة مثيرة لتصور الجزيئات البيولوجية الكبيرة من خلال عيون جديدة. قد يرفع مجال المجهر الإلكتروني السائل من كيفية دراستنا لهذه الفيروسات الجديدة التي تشكل تهديدا لصحة الإنسان ، وربما يساهم حتى في تدابير التأهب للأوبئة.