تطوير التصوير عالي الدقة لتجميعات الفيروسات في السائل والجليد
July 20th, 2022
هنا يتم وصف البروتوكولات لإعداد مجموعات الفيروسات المناسبة لتحليل السائل EM و cryo-EM على المستوى النانوي باستخدام المجهر الإلكتروني المرسل.
ارتفع الاهتمام بالمجهر الإلكتروني السائل في السنوات الأخيرة حيث يمكننا الآن تصور عمليات الوقت الحقيقي على نطاق النانو. يمكن أن تساعدنا المعرفة المحسنة بهذه الهياكل المرنة في تطوير كواشف جديدة لمكافحة مسببات الأمراض الناشئة مثل SARS-CoV-2. تساعد مشاهدة البروتينات في بيئة سائلة على محاكاة الأنظمة الحيوية وتعطينا فرصة للنظر إلى البروتينات بطريقة أكثر ديناميكية.
وستوضح لك هذه التجربة تقنيات جديدة حول كيفية استخدام البروتينات وتصورها في كل من الجليد الزجاجي والبيئات السائلة. تتضمن النتائج الحديثة رؤى ديناميكية للقاحات المرشحة في العلاجات القائمة على الأجسام المضادة المصورة في سائل. تعمل تطبيقات السائل والتبريد الكهرومغناطيسي المترابطة على تعزيز قدرتنا على تصور الديناميات الجزيئية ، مما يوفر سياقا فريدا لصحة الإنسان والمرض.
قد يفكر القراء الذين يستخدمون تقنيات TEM أو cryo-EM التقليدية في تنفيذ تدفقات عمل EM السائلة لتقديم ملاحظات ديناميكية جديدة لعيناتهم بطريقة تكمل استراتيجياتهم الحالية. يمكن أن توفر أنظمة Liquid-EM المتاحة تجاريا التدفق والخلط والمحفزات الكهروكيميائية والتحكم في درجة الحرارة ، والتي تعتبر ضرورية للعديد من تطبيقات التصوير في الوقت الفعلي. تصف طريقة شطيرة الرقاقة الدقيقة المعروضة هنا طريقة بسيطة لمستوى الدخول لعرض العينات أولا في السائل قبل القفز إلى نظام تجاري أكثر تعقيدا للتجارب في الموقع.
للبدء ، قم بتنظيف رقائق نيتريد السيليكون الدقيقة عن طريق احتضان كل شريحة في 150 ملليلتر من الأسيتون لمدة دقيقتين ، تليها الحضانة في 150 ملليلتر من الميثانول لمدة دقيقتين. اترك الرقائق تجف في تدفق الهواء الرقائقي. تقوم البلازما بتنظيف الرقائق المجففة باستخدام أداة تفريغ توهج تعمل في ظل ظروف قياسية لمدة 45 ثانية باستخدام غاز الأرجون.
بعد ذلك ، قم بتحميل رقاقة قاعدة جافة في طرف حامل العينة وأضف حوالي 0.2 ميكرولتر من العينة إلى الشريحة الأساسية. بعد الحضانة لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، ضع الشريحة العلوية على شريحة القاعدة الرطبة التي تحتوي على العينة. قم بزرع المجموعة معا لتشكيل حاوية محكمة الغلق مثبتة في مكانها ميكانيكيا بواسطة ثلاثة براغي نحاسية.
ضخ الطرف إلى 10 إلى ناقص ستة تور باستخدام محطة ضخ جافة يتم ضخها بالتوربو. الحامل جاهز الآن لإدخاله في TEM. تقوم البلازما بتنظيف الرقائق الدقيقة وشبكات الكربون باستخدام أداة تفريغ التوهج لمدة 45 ثانية.
وأضف حوالي ميكرولتر من العينة إلى رقاقة متوهجة مفرغة موضوعة على عبوة هلام. قم بإزالة المحلول الزائد باستخدام ورق الترشيح أو ماصة واحتضانه لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ثم أضف شبكة الكربون المفرغة المتوهجة إلى الرقاقة الدقيقة الرطبة التي تحتوي على العينة.
ازرع المجموعة معا باستخدام حامل عينة إمالة واحد في درجة حرارة الغرفة لتشكيل حاوية محكمة الغلق. بدلا من ذلك ، استخدم مقاطع شبكة التحميل التلقائي وضع مجموعة الساندويتش على مشبك C السفلي. ضع المشبك العلوي أعلى المجموعة واستخدم أداة التثبيت القياسية لإغلاق التجميع معا.
العينة جاهزة الآن لإدخالها في TEM. افحص العينات الموضوعة في اللوادر التلقائية تحت ظروف التبريد أو في درجة حرارة الغرفة. للتصوير السائل EM ، قم بتحميل حامل العينة في TEM المجهز بمسدس انبعاث ميداني ويعمل عند 200 كيلوفولت.
قم بتشغيل البندقية واضبط الارتفاع المركزي لمرحلة المجهر فيما يتعلق بالعينة باستخدام وظيفة المتذبذب ، وإمالة العينة من 15 درجة تحت الصفر إلى 15 درجة زائد في العمود. يضبط هذا الإجراء المرحلة في الاتجاه Z لاستيعاب سمك العينة ويساعد على ضمان التكبير الدقيق أثناء تسجيل الصورة. سجل الصور كأفلام طويلة أو صور فردية باستخدام حزمة برامج جمع البيانات التسلسلية ، وتنفيذ إجراءات التصوير الآلي.
التقط صورا في ظل ظروف جرعة منخفضة بتكبير يتراوح من 28،000X إلى 92،000X و 40 إطارا في الثانية. اضبط أوقات التعرض لتقليل تلف الحزمة للعينة واستخدم نطاق إلغاء التركيز البؤري من ناقص واحد إلى أربعة ميكرومتر عند التكبير المحدد. في حالة مواجهة حل سميك، استخدم قيم إلغاء تركيز بؤري أعلى أو حدد منطقة اهتمام مختلفة.
تأكد من وجود المحلول في العينات طوال جلسة التصوير عن طريق تركيز شعاع الإلكترون على منطقة قربانية لا تستخدم لجمع البيانات حتى تتشكل الفقاعات. قم بتحليل الأفلام بحثا عن جزيئات SARS-CoV-2 باستخدام برنامج RELION-3.0.8 أو أي برنامج آخر لمعالجة الصور. قم بإجراء تصحيح الحركة باستخدام برنامج MotionCor2.
بمجرد التصحيح ، استخرج الجسيمات باستخدام أداة الانتقاء التلقائي في حزمة برامج البرنامج. أحجام الصناديق النموذجية هي 330 بكسل للعينات السائلة و 350 بكسل لعينات الجليد. احسب عمليات إعادة البناء الأولية باستخدام تناظر C1 مع روتين النموذج الأولي ثلاثي الأبعاد للبرنامج وخيارات نموذج ab initio في حزمة برامج معالجة البيانات.
ثم قم بإجراء بروتوكولات التحسين في برنامج معالجة البيانات. افحص النتائج باستخدام حزمة برامج تحليل التركيب الجزيئي أثناء تقييم التغييرات الديناميكية. تظهر هنا مقارنة بين هياكل السائل الكهرومغناطيسي و cryo-EM في النوع الفرعي الثالث من الفيروس المرتبط بالغدي أو AAV.
تظهر الصور التمثيلية بنية AAV في المحلول وفي الجليد. تظهر هنا المناظر الدورانية للوحدة الفرعية AAV VP1 المستخرجة من الهياكل السائلة والجليدية. تمثل هذه الصور القيم الديناميكية في الهياكل السائلة التي تم إنشاؤها باستخدام وظيفة خريطة morph في برنامج تحليل البنية الجزيئية.
تظهر الهياكل المتوسطة من تجميعات الفيروسات المتعددة تغيرات توافقية مع تغير قطري بنسبة 5٪ تقريبا تم قياسه باستخدام بيانات EM. تظهر هنا صورة لتجميعات تحت فيروسية SARS-CoV-2 معزولة من أجزاء المصل من مرضى COVID-19. تشير هذه الفقاعات البيضاء إلى وجود سائل في العينة.
تظهر هنا إعادة بناء EM لهذه التجميعات دون الفيروسية بكثافات شعاعية ملونة عند خمس شرائح نانومتر عبر الخريطة. تصف الصورة التمثيلية تحليل جزيئات فيروس الروتا مزدوجة الطبقات المحضرة في الثلج الزجاجي باستخدام تقنية شطيرة الرقاقة. يجب التقليل من استخدام المنظفات والجلسرين والبولي إيثيلين والجليكول والمستويات العالية من السكريات أو تجنبها للتصوير السائل الكهرومغناطيسي.
قد تدخل هذه الكواشف القطع الأثرية ، وتخلق فقاعات مفرطة ، ومنتجات التحلل المائي ، والجذور الحرة بسبب تلف الحزمة. سيسمح استخدام هذه البروتوكولات للعلماء بأن يكونوا قادرين على دراسة العمليات الديناميكية بالتفاصيل الذرية. وهذا يمتد عبر مجالات متعددة من العلوم بما في ذلك الطب وعلوم الحياة وأبحاث المواد.
تصف البروتوكولات المعروضة هنا كيف يمكن للأدوات الحديثة أن توفر وسيلة مثيرة لتصور الجزيئات البيولوجية الكبيرة من خلال عيون جديدة. قد يرفع مجال المجهر الإلكتروني السائل من كيفية دراستنا لهذه الفيروسات الجديدة التي تشكل تهديدا لصحة الإنسان ، وربما يساهم حتى في تدابير التأهب للأوبئة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تصف هذه المقالة بروتوكولات لإعداد تجميعات الفيروسات التي تكون مناسبة لتحليل EM السائل وcryo-EM على نطاق النانو. تستخدم هذه الطرق المجهر الإلكتروني الانتقالي لتحقيق تصوير مفصل.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- المجهر الإلكتروني
الخلفية
- تلعب تجميعات الفيروسات دورًا حاسمًا في العديد من الدراسات البيولوجية.
- يتيح المجهر الإلكتروني الانتقالي التصوير عالي الدقة.
- يعد EM السائل وcryo-EM تقنيات متقدمة لتحليل النانومتر.
- يمكن أن يساعد فهم هياكل الفيروسات في التطورات العلاجية.
هدف الدراسة
- تقديم بروتوكولات مفصلة لإعداد تجميع الفيروسات.
- تعزيز فهم هياكل الفيروسات باستخدام تقنيات التصوير المتقدمة.
- تسهيل البحث في علم الفيروسات والمجالات ذات الصلة.
الطرق المستخدمة
- إعداد تجميعات الفيروسات.
- تطبيق تقنيات EM السائل.
- استخدام cryo-EM لتحليل النانومتر.
- المجهر الإلكتروني الانتقالي للتصوير.
النتائج الرئيسية
- إعداد ناجح لتجميعات الفيروسات المناسبة لتحليل EM.
- تقريب تقنيات التصوير الفعالة على نطاق النانو.
- رؤى حول الخصائص الهيكلية للفيروسات.
- بروتوكولات يمكن تكرارها للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- توفر البروتوكولات الموضحة طريقة موثوقة لإعداد تجميع الفيروسات.
- يمكن أن تعزز تقنيات التصوير المتقدمة التحليل الهيكلي بشكل كبير.
- تساهم هذه الأبحاث في فهم أعمق للهياكل الفيروسية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-resolution liquid-EM and cryo-EM imaging of virus assemblies enables direct visualization of nanoscale dynamics critical for antiviral and vaccine R&D. Integrating dynamic and static structural data enhances predictive confidence in molecular behavior under physiologically relevant conditions. This capability supports risk-adjusted decisions at key inflection points in biologics and vaccine discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct visualization of viral assembly dynamics informs mechanistic de-risking and target validation.
- Correlative imaging clarifies conformational flexibility relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Dynamic structural insights support prioritization of candidate targets for further development.
Screening & Assay Development
- Preparation of well-defined virus assemblies enables reproducible assay development for compound screening.
- Quantitative imaging outputs facilitate standardization and benchmarking across screening platforms.
- Dynamic observation of molecular assemblies supports robust evaluation of candidate reagents.
Translational & Preclinical Research
- Imaging in liquid environments provides disease-relevant context for translational biomarker alignment.
- Structural continuity from discovery to preclinical validation is enhanced by correlative EM workflows.
- Dynamic data informs risk-adjusted advancement of vaccine and antibody-based therapies.
Pipeline & Workflow Integration
These imaging protocols bridge early discovery and preclinical research by enabling direct, quantitative assessment of viral assemblies in both static and dynamic states.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through real-time nanoscale visualization.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of conformational changes and structural heterogeneity across conditions.
- Translational Research: Aligns molecular imaging with disease-relevant environments for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable imaging capability for diverse viral and protein assemblies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing dynamic structural evidence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of biologics and vaccine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM sample preparation and data analysis software (e.g., RELION, MotionCor2).
- Access to advanced TEM instrumentation with liquid and cryo capabilities is essential.
- Standardization of protocols across teams ensures reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different virus types or protein assemblies.
- Minimizing use of certain reagents (e.g., detergents, glycerol) is critical to avoid imaging artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:43
Loading the Specimen Holder for Liquid-EM
2:47
Production of Microchip Sandwich Assemblies
3:51
Imaging Specimens Using a Transmission Electron Microscope
5:15
Analysis of SARS-CoV-2 Sub-Viral Assemblies in Liquid
6:09
Results: Representative structures of AAV, SARS-CoV-2 Sub-Viral Assemblies and Rotavirus DLPs Prepared in Liquid and Vitreous Ice Using the Microchip Sandwich Technique
7:24
Conclusion
