اتباع ديناميات المتغيرات الهيكلية في المجموعات السكانية المتطورة تجريبيا
فبراير 3, 2023
لقد طورنا طريقة فعالة من حيث التكلفة لمتابعة ديناميكيات أليل تعدد أشكال النوكليوتيدات غير المفردة والتي يمكن تكييفها بسهولة مع أرشيفات التطور التجريبية المجمدة. اقترنت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الثلاثي مع الرحلان الكهربائي الشعري المتوازي الآلي لتحديد التردد النسبي لأليل الإدخال على مدار التطور التجريبي.
كانت المتغيرات الهيكلية مثل الإدراج والحذف والازدواجية والانعكاسات في الماضي أكثر صعوبة في المتابعة تجريبيا ، ولا يمكن قياس تردداتها بدقة عن طريق تسلسل amplicon. نقدم هنا تقنية بسيطة فعالة من حيث التكلفة ، والتي تجمع بين تصميم التمهيدي الثلاثي والفصادة الكهربائية الشعرية المتوازية لمتابعة ترددات الأليل المتغيرة الهيكلية بمرور الوقت. تم تصميم هذه الطريقة لاستكمال تسلسل نقطة النهاية في التطور التجريبي وتتبع ترددات أليلات دي نوفو الناشئة.
نأمل أن تفيد هذه الطريقة أيضا أولئك الذين يعملون مع بيانات مسببات الأمراض داخل المضيفين. ستوضح العملية جين هاميت ، مساعدة باحثة من مختبرنا. سيتم عرض الخطوات المختلفة للطرق في الحالة التي ينتج فيها الأليل المشتق عن إدخال IS10 في جين بكتيري يسمى mutS.
قم أولا بتصميم زوج من الاشعال لتضخيم أمبليكون قصير على أليل النوع البري حول موقع الإدخال الطافر. صمم برايمر تمهيدي أمامي ثالث اثنين ضمن تسلسل الإدراج لإنتاج متغير حجم طفيف من النوع البري amplicon. ابدأ باستخراج الحمض النووي من مزارع على مدار 24 ساعة من النوع البري الثابت واستنساخ الأليل الطافر.
بعد تحديد كمية الحمض النووي ، قم بتخفيف كل مستخلص DNA إلى خمسة نانوجرام لكل ميكرولتر بالماء. ثبت العينتين بنسبة 50/50. قم بإعداد تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على 10 نانوجرام من عينة الحمض النووي والبادئات والمزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل.
بعد ذلك ، افصل منتج PCR عن طريق الرحلان الكهربائي ، باستخدام هلام أغاروز 2٪. يجب التحقق من اختلاف الحجم بين amplicons من النوع البري والمتحولة على الجل. للحصول على منحنى معايرة ، ابدأ بخلط الحمض النووي من النوع البري والحمض النووي الطافر بنسب مختلفة.
تمييع منتجات PCR إلى 0.1 نانوغرام لكل ميكرولتر تركيز. لتحضير جل الفصل ، اخلطي الجل الطازج والصبغة. استبدل المخزن المؤقت للمدخل.
ضع المخزن المؤقت للشطف في موقع الدرج الصحيح لأداة الرحلان الكهربائي الشعري المتوازي. أضف 22 ميكرولترا من علامة المخفف إلى آبار صفيحة بئر 96. أضف الآن ميكرولتر من منتجات PCR المخففة إلى كل عينة جيدا.
إلى بئر واحد ، أضف سلما بحجم الحمض النووي من مجموعة عالية الحساسية ، يتراوح حجمها من واحد إلى 6000 زوج أساسي. ضع الصفيحة الدقيقة في أداة الرحلان الكهربائي الشعري المتوازي في تشغيل محدد على برنامج الجهاز. تحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل البيانات.
أولا ، حدد القمم بناء على حجمها المعروف. قم بقياس كل amplicon لإنتاج منحنى معايرة. وأخيرا، تحقق من قياس الكميات النسبية للأليلين قياسا صحيحا.
ثم يتم استخدام منحنى المعايرة هذا لحساب كمية المتغيرات الهيكلية بعد تضخيم PCR والرحلان الكهربائي الشعري المتوازي. تتبع هذه النتائج التمثيلية إدخالا مدمرا في جين mutS. تؤدي الضربات القاضية و mutS إلى نمط ظاهري مفرط الطفرات ، مما يسمح للبكتيريا بأخذ عينات من طفرات أكثر من معدل الطفرة الأساسية.
باستخدام الطريقة المقدمة ، تم تتبع تردد المتغير الهيكلي mutS عبر 1000 جيل. تم الكشف عن مسار غير رتيب للأليل الطافر الناشئ. تم اكتشاف الأليل الطافر لأول مرة في الجيل 680.
ثم زاد الأليل بسرعة في التردد ، ليصل إلى 67 ٪ بحلول الجيل 713. ثم ركدت هذه الزيادة ، حيث زادت بنسبة 10٪ فقط على مدى الأجيال ال 53 التالية ، إلى 76٪ بشكل غير متوقع ، انخفض تردد الأليل الطافر من 76٪ إلى 49٪ على مدار 13 جيلا ، وبعد ذلك زاد إلى التثبيت. هذه الطريقة ستفيد أولئك الذين يعملون على التطور التجريبي.
يسمح هذا البروتوكول للمستخدم بأخذ المحفوظات المجمدة واستكشاف المسارات التطورية التي لا يمكن ملاحظتها باستخدام بيانات تسلسل نقطة النهاية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة وفعالة من حيث التكلفة لتتبع ديناميكيات أليلات المتغيرات الهيكلية، وتحديداً عمليات الإقحام، أثناء التطور التجريبي. ومن خلال الجمع بين تصميم البادئات الثلاثية والرحلان الكهربائي الشعيري المتوازي، يمكن لهذه التقنية الكشف عن التغيرات في تردد الأليلات بمرور الوقت، مما يثبت فائدتها في دراسة المسارات التطورية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال البحث
- علم الوراثة
- التطور التجريبي
- المتغيرات الهيكلية
خلفية علمية
- لقد كان من الصعب تقدير المتغيرات التركيبية كمياً باستخدام الطرق التقليدية.
- يعد تضخيم وقياس ترددات أليلات الإقحام أمراً بالغ الأهمية لفهم أدوارها في التطور.
- تهدف هذه الطريقة إلى استكمال تقنيات التسلسل الموجودة حالياً.
الطرق المستخدمة
- تقنية PCR الثلاثية مقترنة بالرحلان الكهربائي الشعري المتوازي الآلي
- نظام نموذج بكتيري (جين mutS)
- التقييم الكمي لترددات الأليلات
النتائج الرئيسية
- تتبع ناجح لمسار غير رتيب لأليل mutS على مدى 1000 جيل.
- كشف عن ديناميكيات معقدة حيث ارتفع تردد الطفرة في البداية، ثم انخفض قبل عملية التثبيت.
- إثبات إمكانية التطبيق في تحليل العينات المجمدة المثبتة للدراسات التطورية.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة طريقة قوية لمراقبة ديناميكيات المتغيرات الهيكلية التي يتم إغفالها عادةً بواسطة تسلسل نقطة النهاية.
- يوفر هذا النهج آثاراً مهمة للباحثين الذين يدرسون التطور التجريبي وديناميكيات مسببات الأمراض.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد قياس ديناميكيات أليل المتغيرات الهيكلية (SV) أمراً بالغ الأهمية لفهم التكيف الجيني والتنوع المظهري في المجموعات الميكروبية والممرضة. تتيح هذه الطريقة تتبعاً دقيقاً وفعالاً من حيث التكلفة لترددات SV، مما يعالج فجوة رئيسية في مرحلة الاكتشاف في علم الجينوم ويدعم الثقة التنبؤية في الدراسات الوظيفية التي تقودها المتغيرات. إن قابليتها للتوسع وتوافقها مع العينات المجمعة يجعل منها أداة قيمة لمسارات الاكتشاف المبكر وأبحاث البحوث الترجمية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح التتبع الكمي لترددات أليل SV لتوضيح الأنماط الظاهرية الناتجة عن المتغيرات.
- يدعم التحقق من الأهداف الوظيفية من خلال مراقبة ظهور الأليلات الجديدة في المجموعات السكانية المتطورة.
- يسهل عملية تقليل المخاطر الميكانيكية عبر الكشف عن مسارات المتغيرات غير الرتيبة بمرور الوقت.
الفحص وتطوير المقايسة
- تجهيز الأنظمة البيولوجية المعتمدة للفحص اللاحق من خلال قياس كمية SVs في العينات المجمعة.
- توحيد معايير الكشف عن SV عبر تصميم بادئات قابل للتكرار وقراءات الفصل الكهربائي الشعري.
- تمكين تحليل متوازٍ وقابل للتوسع مناسب لسير عمل فحص المتغيرات عالي الإنتاجية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يتوافق مع الأنظمة ذات الصلة بالأمراض من خلال تمكين التحديد الكمي للتغيرات الهيكلية (SV) في مجموعات المسببات المرضية داخل المضيف.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري عن طريق تتبع ديناميكيات المتغيرات في العينات المؤرشفة.
- يوفر قيمة تنبؤية لقرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر في أبحاث الميكروبات والمسببات المرضية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندمج هذه الطريقة في التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية من خلال تمكين التتبع الديناميكي للـ SV بدءاً من اختبار الفرضيات المبكر وصولاً إلى الأبحاث الانتقالية، لا سيما في الأنظمة الميكروبية وأنظمة المسببات المرضية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال قياس المتغيرات البنيوية (SVs) الناشئة كمياً.
- الفحص: توفر قياسات كمية وقابلة للتكرار للمتغيرات البنيوية (SVs) لضمان جاهزية المقايسة.
- التحليلات: توفر قياساً كمياً قائماً على المعايرة وتحليلاً مقارناً لترددات الأليلات.
- الأبحاث الانتقالية: تمكن من تتبع المتغيرات البنيوية (SVs) في المجموعات الطبيعية والمجموعات داخل المضيف، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر سير عمل فعال من حيث التكلفة وقابل للتطبيق على نطاق واسع لقياس المتغيرات البنيوية (SVs) كمياً عبر مشاريع متنوعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في الدراسات التي تعتمد على المتغيرات الهيكلية (SV).
- القيمة التشغيلية: توفر تقديراً كمياً للمتغيرات الهيكلية (SV) يتسم بالمعيارية والقابلية للتوسع والتكرار.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) وكفاءة رأس المال من خلال توضيح تأثير المتغيرات في مرحلة مبكرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأهداف والنماذج المتعلقة بالمتغيرات الهيكلية (SV) بناءً على تقييم المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصميم البادئات وأجهزة الفصل الكهربائي الشعري.
- يستلزم إمكانية الوصول إلى الفصل الكهربائي الشعري المتوازي وبرامج التحليل الكمي.
- يتطلب توحيداً قياسياً بين الفرق لبروتوكولات المعايرة والتقييس.
- قابل للتكيف مع أنواع مختلفة من المتغيرات البنيوية (SV) وسياقات العينات المجمعة باستخدام مجموعات البادئات المناسبة.
- محدود بضرورة وجود فروق قابلة للكشف في حجم قطعة التضخيم ودقة المعايرة.
