توليد جينومات بكتيرية كاملة من العينات السريرية باستخدام سير عمل التخصيب المستهدف

يمكن أن توفر الجينومات معلومات عن أصل العامل الممرض وانتقاله وقدراته. بالنسبة للبكتيريا غير القابلة للزراعة ، لا يمكن الحصول على هذه المعلومات إلا من خلال التخصيب المستهدف. يعد تسلسل مسببات الأمراض البكتيرية مباشرة من العينات السريرية أمرا صعبا بسبب الحمض النووي البشري الساحق ، والكائنات الحية الدقيقة المتنوعة والأحمال البكتيرية المنخفضة للغاية.

في كثير من الحالات ، لا تكون الثقافة خيارا ، بسبب طريقة أخذ العينات والبكتيريا الحساسة. أثناء تطبيق هذه التقنية على البكتيريا المنقولة جنسيا ، اكتشفنا سلالة جديدة من الكلاميديا الحثرية LGV تسمى ompA-genotype L4 ، وأكدنا التوسع العالمي لسلالة LGV المهيمنة ، مما يوفر نظرة ثاقبة رئيسية للتشخيص الجزيئي والمراقبة الوبائية. يتيح بروتوكول إثراء التقدم هذا التعافي الكامل للجينوم من العينات السريرية المصابة بالأمراض المنقولة جنسيا المشخصة بشكل إيجابي.

وجدنا أن هذه التقنية تتفوق على التسلسل العميق للميتاجينومية ، واستنفاد الحمض النووي للمضيف ، والتسلسل التكيفي للمسام النانوية. نحن نحقق في السلالات المنتشرة لهذه مسببات الأمراض في جميع أنحاء أوروبا والأرجنتين. هذا لديه القدرة على الإبلاغ عن انتقال العدوى والإشراف على مضادات الميكروبات.

للبدء ، قم بقياس تركيز الحمض النووي لمستطفات الحمض النووي من العينات السريرية باستخدام طريقة حساسة ودقيقة قائمة على التألق. قم بتخفيف كل عينة من الحمض النووي باستخدام ماء خال من النوكلياز إلى 10 إلى 200 نانوجرام في حجم نهائي يبلغ 17 ميكرولتر في كل شريط أنبوب PCR. أضف 3 ميكرولتر من مزيج التجزئة الرئيسي إلى كل بئر يحتوي على 17 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف.

ماصة لأعلى ولأسفل 20 مرة لخلطها جيدا. ثم أغلق شريط أنبوب PCR. قم بتدوير الشريط بسرعة عالية لمدة 10 ثوان وقم بالدوران لفترة وجيزة لجمع المحتويات.

بعد ذلك ، ضع شريط أنبوب PCR في جهاز التدوير الحراري وابدأ البروتوكول المبرمج مسبقا للتجزئة والحضانة. بعد ذلك ، قم بإعداد الإصلاح النهائي والمزيج الرئيسي dA-tailing كما هو موضح في الجدول. دوامة وتدوير الأنبوب كما هو موضح سابقا واحتفظ به على الجليد.

بعد ذلك ، يتم خلط ماصة 20 ميكرولتر من الإصلاح النهائي ومخلف dA الرئيسي في كل بئر يحتوي على 50 ميكرولتر من شظايا الحمض النووي. أغلق الشريط والدوامة بسرعة عالية لمدة ثماني ثوان. بعد تدوير الشريط لفترة وجيزة ، ضعه مرة أخرى في جهاز التدوير الحراري.

بمجرد انتهاء برنامج التدوير الحراري ، ضع شريط أنبوب PCR على الثلج. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لربط درجة حرارة الغرفة ، والذي تم تحضيره قبل 30 إلى 45 دقيقة لكل بئر يحتوي على شظايا الحمض النووي. أضف 5 ميكرولتر من مزيج oligo المحول للمكتبات ذات العلامات NBC إلى كل بئر.

ضع شريط أنبوب PCR على الفور مرة أخرى في جهاز التدوير الحراري واستمر في البرنامج. لبدء تنقية الحمض النووي ، استرجع الخرزات المغناطيسية من 4 درجات مئوية واتركها تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. ثم أضف 80 ميكرولتر إلى كل عينة جيدا.

ضع شريط أنبوب PCR على الحامل المغناطيسي واغسل كل بئر مرتين ب 200 ميكرولتر من 70٪ إيثانول. انتظر لمدة دقيقة واحدة أثناء كل غسلة وقم بإزالة الإيثانول بعناية دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بعد خلط واحتضان الخرزات مع 35 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز لمدة خمس دقائق ، قم بشفط المادة الطافية التي تم تطهيرها بعناية من كل بئر ونقله إلى بئر مقابل في شريط أنبوب PCR جديد.

ضع شريط أنبوب PCR الجديد على الثلج وتخلص من الخرز المغناطيسي. خذ مزيج تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المحضر قبل الاستعادة وأضف 11 ميكرولتر منه إلى كل عينة جيدة تحتوي على مكتبة الحمض النووي المنقى. أضف 5 ميكرولتر من الإصلاح الرئيسي للمؤشر المحدد لكل تفاعل وأغلق شريط أنبوب PCR.

ابدأ برنامج التدوير الحراري لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو محدد في الجدول لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل الالتقاط. أضف شريط أنبوب PCR فقط بمجرد وصول جهاز التدوير الحراري إلى 98 درجة مئوية. بعد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل المسبق ، قم بإجراء تنظيف آخر قائم على الخرزة لتنقية المكتبة.

احتضان منتج PCR بالخرز المغناطيسي. بعد ذلك ، ضع أنبوب شريط تفاعل البوليميراز المتسلسل على جهاز فصل مغناطيسي وانتظر من 5 إلى 10 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا. بينما يظل الشريط على الحامل المغناطيسي ، قم بإزالة المادة الطافية الشفافة بعناية وتجاهلها من كل بئر.

بعد ذلك ، قم بإزالة الحمض النووي في 15 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز وقياس تركيز الحمض النووي لمكتبة الحمض النووي المنقى. لتهجين العينة ، قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري وفقا للبروتوكول المحدد هنا. ابدأ البرنامج وأوقف التشغيل مؤقتا على الفور.

قم بتخفيف 500 إلى 1,000 نانوجرام من مكتبات الحمض النووي المعدة إلى حجم نهائي يبلغ 12 ميكرولتر باستخدام ماء خال من النوكلياز. بعد الدوامة والدوران لأسفل مزيج مانع قليل النوكليوتيدات ، أضف 5 ميكرولتر إلى كل أنبوب عينة. أغلق شريط أنبوب PCR وضعه في جهاز التدوير الحراري.

أوقف جهاز التدوير الحراري مؤقتا عندما يصل إلى الخطوة الثالثة من البروتوكول. أضف 13 ميكرولترا من مزيج تهجين مسبار درجة حرارة الغرفة المحضر إلى كل عينة مع الحفاظ على الشريط داخل جهاز التدوير الحراري. ماصة ببطء لأعلى ولأسفل من 8 إلى 10 مرات للخلط.

تأكد من عدم وجود فقاعات هواء ، ووضع الشريط مرة أخرى في جهاز التدوير الحراري. ثم تأكد من أن جميع الأنابيب محكمة الإغلاق. لالتقاط المكتبة المهجنة، انقل الحجم بالكامل من كل أنبوب إلى الأنابيب المقابلة التي تحتوي على 200 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين المغسولة مسبقا.

اجمع حبات الستربتافيدين قبل غسلها بمخزن غسيل بدرجة حرارة الغرفة. بمجرد إزالة شريط أنبوب PCR من الفاصل المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل ذو درجة الحرارة العالية الذي تم تسخينه مسبقا إلى 70 درجة مئوية وأعد تعليق الخرزات عن طريق سحب العاصة لأعلى ولأسفل. أغلق شريط الأنبوب ، والدوامة بسرعة عالية ، وقم بالدوران بسرعة كما هو موضح سابقا.

ضع شريط الأنبوب المغلق في كتلة التدوير الحراري على حرارة 70 درجة مئوية واحتضنه لمدة 5 دقائق. انقل شريط أنبوب PCR من جهاز التدوير الحراري مرة أخرى إلى الفاصل المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة. انتظر لمدة دقيقة واحدة حتى يصبح الحل واضحا.

ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية وتجاهلها. ثم أضف 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى كل أنبوب يحتوي على الخرز. قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري كما هو محدد في الجدول الموضح هنا.

أضف 25 ميكرولتر من مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المحضر بعد الالتقاط إلى كل أنبوب عينة. امزج التفاعل حتى يصبح التعليق موحدا ، وأغلق شريط أنبوب PCR بإحكام دون تدويره. ضع شريط أنبوب PCR المغلق في جهاز التدوير الحراري.

بعد نقل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أنبوب جديد ، أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخرزة إلى كل أنبوب عينة وقم بإجراء تنظيف الحمض النووي كما هو موضح سابقا. قياس تركيز الحمض النووي للحمض النووي للمكتبة المنقاة النهائية باستخدام طريقة القياس الكمي القائمة على التألق. أدى التخصيب المستهدف إلى نسب مئوية أعلى بكثير من القراءات المستهدفة ، وبالتالي الجينوم الكامل مقارنة بالتسلسل المباشر عبر جميع مسببات الأمراض التي تم اختبارها ، بما في ذلك الكلاميديا الحثرية ، والنيسرية البنية ، واللولبية الشاحبة ، والميكوبلازما التناسلية.

لوحظ نجاح تسلسل الجينوم في الغالب في العينات ذات قيم عتبة دورة qPCR أقل من 30 لجميع مسببات الأمراض الأربعة. مع وجود علاقة عكسية واضحة بين قيم التصوير المقطعي المحوسب والنسبة المئوية للقراءات المستهدفة للكلاميديا الحثرية. باستخدام درجة حرارة تهجين تبلغ 62.5 درجة مئوية مقارنة ب 65 درجة مئوية السابقة ، أدى إلى تحسين تغطية الجينوم للميكوبلازما التناسلية دون تقليل أداء مسببات الأمراض المستهدفة الأخرى.

أظهر تحليل النشوء والتطور لجينومات الكلاميديا الحثرية من الأرجنتين العديد من العينات تتجمع داخل كليد L2b وكشف عن سلالة جديدة مقترحة على أنها نمط وراثي ompA-L4 مفصولة عن جميع جينومات LGV السابقة بحوالي 600 تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة.