Summary
Questa procedura descrive l'individuazione e isolamento di mouse leucociti TH17 che attivamente secernono IL-17 sulla stimolazione.
Abstract
La secrezione delle citochine MACS tecnologia di analisi permette di individuare i citochine secrete a livello di singola cellula e l'isolamento sensibile di valide cellule che secernono citochine. Al fine di etichetta IL-17-cellule che secernono, una sospensione singola cella di splenociti mouse è preparato e stimolato a 37 ° C con PMA / ionomicina per indurre la secrezione di citochine. Per arrestare la secrezione delle cellule vengono poi immessi sul ghiaccio e sono esposti al IL-17 reagente Catch a bi-anticorpo specifico che si lega al CD45 sulla superficie cellulare dei leucociti e di IL-17 come è secreta e catturato vicino alla superficie della cellula. Secrezione è poi ri-iniziata aumentando la temperatura a 37 ° C e IL-17 è intrappolato dal reagente Catch. Secrezione è poi fermato di nuovo, mettendo cellule su ghiaccio. Per rilevare l'IL-17 intrappolati, le cellule vengono incubate con un secondo IL-17-anticorpo specifico coniugato con biotina e un anti-biotina-PE anticorpi. Le cellule possono ora essere analizzati direttamente mediante citometria di flusso o preparati per l'isolamento e l'arricchimento per l'etichettatura successive con Anti-PE microsfere coniugate.
Protocol
Preparazione dei reagenti
- Fai un buffer contenente PBS con BSA (0,5%), e 2 mM EDTA. Perché le bolle d'aria in grado di bloccare colonne di separazione MACS, il buffer deve essere degassata e conservato a 2-8 ° C prima dell'uso.
- Noi usiamo RPMI 1640 medium contenente siero del mouse 5%. Il terreno di coltura non deve contenere BSA o FCS, in quanto questi composti alterano la specificità della stimolazione delle cellule.
- L'IL-17 mouse Assay secrezione - Arricchimento delle cellule e Detection Kit-da Miltenyi Biotec. Il kit contiene i seguenti componenti: l'IL-17 reagente di cattura, la IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina), l'anti-biotina-PE, e l'Anti-PE microsfere.
Stimolare il splenociti
- Questo protocollo è eseguita in presenza di un controllo negativo e positivo, come splenociti non stimolate e di contrasto per le cellule T. Questo protocollo è eseguita con tecnica sterile.
- Preparare una sospensione singola cella di splenociti mouse che sono stati isolati utilizzando il dissociatore gentleMACS ™. La concentrazione di cellule devono essere predeterminati attraverso il conteggio delle cellule. Agglomerare le cellule a 200 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante fuori il pellet con una pipetta. Non decantare il tubo per evitare la perdita del pellet.
- Ora, risospendere le cellule nel mezzo di coltura e quindi aggiungere ad un pozzo. Aggiungere mezzo sufficiente per una concentrazione di dieci milioni di cellule per mL e cinque milioni di cellule per centimetro quadrato.
- Per stimolare una risposta immunitaria nelle nostre cellule risospese, aggiungiamo ionomicina (1 mg / mL) e PMA (10 ng / ml) al campione e mescolare la soluzione pipettando gentilmente su e giù. Poi i pozzi sono debitamente etichettati.
- Ora, noi incubare le nostre cellule per 3 ore a 37 ° C senza miscelazione per iniziare il periodo di stimolazione. Procedere alla IL-17 analisi 3 ore dalla comparsa dei stimolazione, in modo da pianificare di conseguenza.
- Per interrompere la secrezione, le cellule sono immessi sul ghiaccio e raccogliamo le cellule stimolate pipettando gentilmente su e giù con il tampone a freddo. Le cellule sono poi trasferiti dal bene a un tubo e vengono lavati una seconda volta.
- Per garantire che tutte le cellule vengono raccolte, è una buona idea controllare il vostro piatto al microscopio. Se le cellule sono ancora attaccato, è possibile raccogliere le cellule rimanenti risciacquando il piatto con il tampone a freddo. Eventuali grumi di cellule in sospensione cellulare può essere rimosso utilizzando il pre-separazione filtri.
Etichettare le cellule con reagente Cattura
- E 'fondamentale notare che questo test funziona in modo ottimale se meno del 2% di IL-17-secernenti cellule sono presenti.
- Se la concentrazione di IL-17 le cellule secernenti dovrebbe essere superiore al 2% regolare i volumi di conseguenza.
- Un potenziale problema di questa procedura è la contaminazione incrociata dei reagenti Catch, che può verificarsi durante l'etichettatura quando il bi-specifico anticorpo si lega ad un non-secernenti delle cellule T e le trappole IL-17 secreta da un linfocita vicini, generando falsi positivi.
- Per aggirare questo problema, è fondamentale per le cellule raffreddare prima dell'etichettatura e lavorare con tampone a freddo per rallentare la diffusione di IL-17 e di evitare la contaminazione incrociata. Oltre a mantenere le celle frigorifere, devono essere mantenuti ad una concentrazione definita.
- Per iniziare la procedura di etichettatura, si usa 10.000.000 cellule in una provetta da 15 ml richiudibili. Se il numero di cellule superiore devono essere utilizzati, semplicemente scala di tutti i volumi di conseguenza. Una volta che la concentrazione cellulare ottimale è stata ottenuta, lavare le cellule con l'aggiunta di 10 ml di tampone a freddo.
- Spin giù le cellule a 300 × g per 10 minuti in una centrifuga refrigerata (2-8 ° C).
- Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante completamente con una pipetta. Non decantare il sopranatante come questo porterà alla perdita di cellule e volumi impreciso. Ripetere la fase di lavaggio, che consiste di aggiungere 10 ml di tampone a freddo, centrifugazione, e aspirazione.
- Ora che abbiamo un pellet di purezza desiderato, risospendere le cellule in 80 ml di terreno di coltura a freddo. Etichettarli, noi ora aggiungere 20 ml di mouse IL-17 reagente Catch.
- Incubare le cellule per 5 minuti in ghiaccio.
- Dopo il periodo di incubazione di 5 minuti sul ghiaccio, rimuovere il tubo e diluire le cellule in 10 ml di 37 ° C di media caldi. Poi fissare il tubo sul Tubo Rotator MACSmix e incubare il tubo a 37 ° C per 45 minuti sotto continuo movimento. L'aumento della temperatura a 37 ° C ripartirà secrezione di citochine.
Etichettare le cellule con IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina) e anti-biotina-PE
- Dopo il periodo di secrezione 45 minuti a 37 ° C, mettere il tubo immediatamente in ghiaccio. Questo fermerà la secrezione di citochine. Da qui in poi è fondamentale per mantenere le cellule in ghiaccio.Lavorare con tampone freddo evitare la contaminazione crociata dei reagenti Catch.
- Riempire il tubo con tampone a freddo e centrifugare a 300xg a 2-8 ° C per 10 min. Aspirare il surnatante completamente. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
- Il pellet cellulare è risospeso in 80 ml di tampone a freddo e il tubo è posto su ghiaccio.
- Per evitare il legame non specifico degli anticorpi, si consiglia l'aggiunta di reagente FCR 10μl di blocco e incubare in ghiaccio per 5 min. Poi si aggiungono 20 l di mouse IL-17 Individuazione di anticorpi (biotina) che è coniugato con biotina e incubare per 10 minuti in ghiaccio.
- Ancora una volta, lavare le cellule come abbiamo fatto prima con l'aggiunta di 10 mL di tampone a freddo e centrifugare a 300xg a 2-8 ° C per 10 min.
- Ora aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 80 ml di tampone a freddo.
- Aggiungere 20 ml di nostro anticorpo secondario, anti-biotina-PE.
- Mescolare le cellule e la soluzione di anticorpo secondario, incubare e di nuovo il tubo per 10 minuti in ghiaccio.
- Una volta che questa seconda incubazione è completa, lavare le cellule con 10 mL di tampone fredda e centrifuga.
- Il pellet può essere risospeso in 500 ml di tampone a freddo.
- Se le cellule devono essere separati per ulteriori analisi a valle, possono essere magneticamente etichettati con Anti-PE-microsfere e separati manualmente o automatizzati con colonne MACS e separatori MACS.
- Ora abbiamo completato l'etichettatura del splenociti e sono pronti per l'analisi.
FACS analisi
- Per la nostra analisi, metteremo a confronto i splenociti stimolati e non stimolate mediante citometria a flusso.
- Prima di citometria a flusso, le cellule sono colorate con ioduro di propidio a 0,5 mg / ml per escludere le cellule morte. L'analizzatore MACSQuant ™ è stato caricato con 200.000 cellule per ogni campione e che ora stanno andando a guardare le trame dispersione di reattività anticorpale relativa nei campioni. Due considerazioni importanti per l'analisi di cellule rare - come IL-17 cellule positive - mediante citometria di flusso sono:
- impostazione di un cancello sulla linfociti nel scatter in avanti rispetto a scatter plot lato
- gating e fuori le cellule morte (colorate con ioduro di propidio) e B-cellule (che possono provocare colorazione aspecifica di fondo) per migliorare ulteriormente la sensibilità di rilevazione
- Abbiamo usato CD4-APC anticorpi per rilevare le cellule T e l'anticorpo CD45R/B220-PerCP per rilevare le cellule B. Vediamo le proprietà scatter in avanti e laterale dei campioni e applicare un gate sulla popolazione linfocitaria.
- Una seconda porta è stata applicata per vedere le cellule colorate le cellule morte e B colorate (asse Y). Queste cellule sono esclusi dall'analisi delle cellule T.
- In questo esempio, che è essenzialmente negativo del nostro controllo, possiamo vedere che ci sono pochissimi IL-17 CD4 cellule che secernono positivo T nei campioni non stimolata - circa il 0,003% (Figura 4). Guardando alla popolazione di cellule T stimolate, possiamo vedere un numero consistente di cellule T CD4 positive che secernono IL-17 - circa 0,367% (Figura 5A) prima della separazione e 60,76% dopo la separazione magnetica con MACS Technology (Figura 5B).
Discussion
Cellule TH17 giocano un ruolo fondamentale nel immunità adattativa e la risposta infiammatoria e sono una componente chiave nel guidare l'infiammazione autoimmune.
Questo video documenta come utilizzare il mouse Miltenyi di IL-17 Assay secrezione - Arricchimento cellulare e kit di rilevamento (PE). Nel fare questa procedura è importante avere una stima della frequenza di IL-17-cellule che secernono nella vostra preparazione delle cellule di partenza. La concentrazione cella appropriata durante l'etichettatura e la secrezione di citochine periodo impedisce la contaminazione incrociata da altre cellule in sospensione e assicura risultati affidabili.
Disclosures
Tutti i protocolli e le schede tecniche sono disponibili presso www.miltenyibiotec.com.
Avvertenze
I reagenti contengono sodio azide. In condizioni di acidità sodio azide produce acido idrazoico, che è estremamente tossico. I composti devono essere diluiti con acqua corrente prima di smaltimento. Queste precauzioni sono raccomandate per evitare depositi nelle tubazioni che esplosivo può sviluppare.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-094-213 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx |
RPMI 1640 | Medium | Miltenyi Biotec | 130-091-440 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx |
CD4-APC | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-611 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx |
CD8a-FITC | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-605 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx |
Propidium Iodide Solution | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
FcR Blocking reagent, mouse | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx |
Dead Cell Removal Kit | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
MACSmix Tube Rotator | Instrument | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx |
gentleMACS™ Dissociator | Instrument | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
autoMACS Pro Starting Kit | Instrument | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx |
MACS Columns | Tool | Miltenyi Biotec | http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx | |
MACS Separator | Tool | Miltenyi Biotec |