Summary
Questa procedura dimostra la purificazione e l'espansione in vitro di cellule CD4 + antigene specifico le cellule T del sangue periferico da tutto e la loro visualizzazione utilizzando tetrameri MHC di classe II. Tetrameri consentire la visualizzazione diretta delle cellule T con una singola specificità antigenica e definito MHC di classe II restrizione.
Abstract
Complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II tetrameri consentire la visualizzazione diretta dei CD4 + antigene specifico le cellule T mediante citometria di flusso. Questo metodo si basa sulla interazione altamente specifica tra peptide caricato MHC e il corrispondente delle cellule T del recettore. Mentre l'affinità di un singolo MHC / peptide molecola è bassa, il cross-linking complessi MHC / peptide con streptavidina aumenta l'avidità di interazione, consentendo il loro impiego come reagenti di colorazione. A causa delle frequenze relativamente basso di cellule CD4 + T (~ 1 in 300.000 per una specificità unica) questo saggio si avvale di una fase di amplificazione in vitro di aumentare la soglia di rilevazione. Cellule mononucleate sono purificati dal sangue periferico da sottofondo Ficoll. Cellule CD4 + sono poi separati da selezione negativa utilizzando cocktail biotinilato anticorpi e perle di anticorpi anti-biotina magnetico. Utilizzando cellule aderenti dalla frazione di cellule CD4 come cellule presentanti l'antigene, cellule T CD4 + sono espanse in media con l'aggiunta di un peptide antigenico e IL-2. Le cellule espanse sono colorati con la corrispondente classe II tetramero di incubazione a 37 ° C per un'ora e successivamente colorati con anticorpi di superficie come anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Dopo l'etichettatura, le cellule possono essere analizzati direttamente mediante citometria di flusso. Le cellule tetramero positivo tipicamente formano una popolazione distinta tra le cellule CD4 + espanse. Cellule tetramero positivi sono di solito CD25 + CD4 e spesso elevata. Perché il livello di colorazione di fondo tetramero possono variare, risultati colorazione positiva deve essere sempre rispetto alla colorazione delle stesse cellule con un tetramero irrilevante. Più varianti di questo test di base sono possibili. Cellule tetramero positivi possono essere ordinati per ulteriori analisi fenotipica, l'inclusione in ELISPOT o saggi di proliferazione, o altre prove secondarie. Diversi gruppi hanno anche dimostrato di co-colorazione con tetrameri e uno anti-citochine o anti-FoxP3 anticorpi.
Protocol
1. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) isolamento
- Ottenere un campione di sangue - sangue deve essere raccolti in siringhe o provette di sangue e anti-coagulato con eparina (1:50 ratio) per prevenire la coagulazione. Aspettatevi una resa di circa 1 × 10 6 PBMC per ml di sangue - circa il 40% dei quali sarà CD4 positivi (CD4 +) le cellule T.
- Aliquota del sangue in 50 mL coniche, 25 ml per provetta. Se il sangue si è separata, mescolare delicatamente prima aliquoting per distribuire il plasma
- Aggiungi PBS, portando il volume totale di 40 ml e alla base attraverso l'elaborazione di 11 ml di Ficoll, inserendo nel tubo di sangue, e con attenzione rimuovere il Aid pipetta dalla pipetta. Il Ficoll lentamente scarico nella parte inferiore del tubo. Una volta che il livello ha pareggiato, rimuovere lentamente la pipetta dal tubo di sangue e scartare.
- Cap tube di sangue e spostare i contenitori in Aerosolve. Chiudere saldamente i contenitori e centrifugare a 900 × g per 20 minuti - senza freno. E 'fondamentale che nessun freno alla fine di questo giro, come la forza frenante sarà disturbare lo strato di cellule.
- Dopo lo spin, il PBMC dovrebbero formare uno strato bianco distinta tra il plasma gialla (sopra) e Ficoll trasparente (sotto). Delicatamente sfiorano bianco sporco strato di cellule del sangue con una pipetta di trasferimento e trasferimento a nuovo tubo. Alcuni plasma e Ficoll può essere redatto con l'PBMC, ma evitare di elaborare una qualsiasi dello strato di globuli rossi. Tipicamente due tubi di sangue possono essere combinati in un unico tubo di cellule in questa fase per aumentare la dimensione delle pastiglie.
- Aggiungi PBS, portando il volume totale di 50 ml e centrifugare a 500 × g per 15 minuti - freno a basso contenuto di contenitori aerosolve.
- Aspirare il liquido con una pipetta Pasteur, facendo attenzione a non disturbare il pellet
- Trattare con tampone emolitica con l'aggiunta di 5-6 ml per ogni provetta e mescolare delicatamente per eliminare grumi. Incubare per non più di 5 minuti.
- Aggiungi PBS, portando il volume totale di 50 ml e centrifugare a 230 × g per 10 minuti - freni. Contenitori Aerosolve non sono più necessarie per questi giri più lento.
- Lavare due volte: Aspirare il liquido con una pipetta Pasteur, riempire tubo con PBS e centrifugare a 230 × g per 10 minuti.
- Prima della fase di lavaggio finale, rimuovere una aliquota di cellule risospese, diluire con trypan blu, e contare con un emocitometro. Questo conteggio delle cellule detterà i volumi di reagente utilizzato nella fase di separazione delle cellule T.
2. * Delle cellule CD4 + T separazione
- Aspirare il liquido e aggiungere tampone di corsa per portare il volume totale fino a 40 uL per 10 milioni di cellule. Di solito questo richiede 30 uL di tampone più il volume residuo di pellet.
- Trasferire questo volume ad un tubo da 15 ml.
- Aggiungi cocktail di anticorpi dal kit isolamento CD4 - 10 uL per 10 milioni di cellule, tubo tappo, e il luogo in ghiaccio per 10 minuti
- Rimuovere la provetta dal ghiaccio, rimuovere il tappo, e aggiungere 30 uL di funzionamento del buffer per 10 milioni di cellule
- Aggiungi sfere magnetiche dal kit isolamento CD4 - 20 uL per 10 milioni di cellule, tubo tappo, e il luogo in ghiaccio per 15 minuti
- Aggiungi dieci volumi di correre tampone per lavare e centrifugare a 230 × g per 10 minuti.
- Durante la rotazione, istituito il magnete e 5 ml in tubo di polipropilene di lavoro
- Aspirare il liquido da pellet, aggiungere 2 mL di tampone di corsa e rimuovere i grumi con una pipetta di trasferimento
- Utilizzando la pipetta stesso trasferimento, trasferire le cellule in provetta da 5 ml ed incubare nel magnete per 15 minuti
- Con attenzione decantare il CD4 + frazione di cellule in una marcata 15 ml tubo invertendo il magnete e lo svuotamento tutte ma l'ultima goccia
- Aggiungere altri 2 ml di esecuzione tampone nella provetta 5 ml e rimuovere dal magnete
- Lavare delicatamente le cellule CD4 i lati della provetta e trasferire a una marcata tubo 15 ml
- Aggiungere 2 ml di medium di cellule T ad ogni provetta, rimuovere aliquote per il conteggio delle cellule e centrifugare a 230 × g per 10 minuti.
- Diluire aliquote cella con trypan blu e contare con un emocitometro. Queste conta delle cellule detterà il numero di pozzi utilizzati per la fase di espansione della cultura.
* In alternativa, colonne e perline MACS (Miltenyi Biotec), il separatore cellulare AutoMACS (Miltenyi Biotec), o separatore cellulare Robosep (Stem Cell Technologies) può essere utilizzato in base alle istruzioni produce al posto di passi 2,2-2,11.
3. Nella cultura di espansione in vitro
- Aspirare il liquido dalla CD4 + e CD4-cell pellet e, in base alla conta delle cellule, aggiungere terreni di coltura (di solito 3 milioni CD4 + cellule per ml e 10 milioni di CD4-cellule per mL funziona bene per l'impostazione della cultura). La cultura di espansione richiede 3-5000000-CD4 cellule per pozzetto e 2-3000000 CD4 + cellule per pozzetto in un volume totale di media 1 ml la cultura in un piatto ben 48 cultura. Tipicamente, le cellule CD4 + sono la popolazione limitando
- Se lo si desidera, irradiare le cellule CD4 (5000 Rad s). Aliquota di cellule CD4 in numero appropriato di pozzi su un piatto ben 48 con l'aggiunta di 300-500 microlitri a ciascuno. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per 1 ora. L'aderente cellule CD4-servirà come cellule presentanti l'antigene nella cultura di espansione.
- Togliere la placca dal termostato.
- Lavare i pozzetti aggiungendo 500 uL di mezzi freschi e pipettando gentilmente su e giù per 12-20 volte utilizzando una pipetta di trasferimento e la rimozione di tutto il liquido. Questo lavaggio si lascerà alle spalle uno strato di cellule che presentano l'antigene aderenti.
- Quando il lavaggio è completo, aggiungere media appena sufficiente a bagnare il fondo di ciascun pozzetto (circa 100 uL) - altrimenti le cellule aderenti si asciughino
- Aggiungi 2-3000000 cellule CD4 + in ciascun pozzetto. Se necessario, aggiungere ulteriori mezzi per portare il volume totale di ogni bene fino a 1 ml.
- Aggiungere il peptide desiderato in ogni pozzetto. La concentrazione tipico per la stimolazione è di 10 ug / mL finale.
- Mettere in una piastra di 37 ° C incubatore per 7 giorni.
- Dopo 7 giorni, aggiungere 50 uL di Hemogen IL-2 (o equivalente, come ricombinante IL-2, 10 IU / mL) a ciascun pozzetto.
- Nei giorni successivi, monitorare la crescita delle cellule utilizzando un microscopio. Avanzamento pozzi che non sono ancora confluenti rimuovendo la metà dei mezzi di comunicazione, l'aggiunta di mezzi freschi e 50 uL di IL-2. Split pozzi confluenti da risospendere le cellule, spostando la metà delle cellule di un pozzo vuoto, l'aggiunta di mezzi freschi e 50 uL di IL-2. Ritorno alle cellule di incubatrice.
- Le cellule in espansione sarà pronto per tetramero dopo 13-15 giorni di coltura.
4. Visualizzare le cellule T dalla colorazione tetramero
- Acquisto o assemblare tetrameri per abbinare le combinazioni peptide / MHC che corrispondono ai CD4 + stimolato le cellule T (vedi la discussione per le fonti di reagenti tetramero). Tetrameri dovrebbe essere ~ 0,5 mg / ml soluzione.
- Rimuovere la piastra da incubatore
- Con attenzione erogare la metà dei mezzi di comunicazione di ogni bene
- Trasferire un'aliquota di cellule da ogni pozzetto - tipicamente 75 microlitri o circa 50.000 cellule - in polistirolo 5 ml tubo FACS
- Aggiungi tetramero - tipicamente 1 ml per 50 microlitri di volume totale - e il luogo in incubatore a 37 ° C per 1-2 ore. Si consiglia inoltre di macchiare un seconda aliquota di cellule di ogni bene con un tetramero non corrispondenti come controllo negativo.
- Cellule etichetta con anti-CD3, anti-CD4, ed anticorpi anti-CD25 con l'aggiunta di 30-10 l di ogni anticorpo. Marcatori anticorpali aggiuntivi o alternativi possono essere utilizzati. Tuttavia, non utilizzare gli anticorpi PE etichettati dal momento che questo canale deve essere riservato al tetrameri. In questo momento, anche etichetta controlli singolo colore o isotipo utilizzando cellule in più.
- Incubare cellule anticorpo marcato per 15-30 minuti in ghiaccio o a 4 ° C.
- Lavare ciascuna provetta con 0,5 a 2 ml in esecuzione tampone e centrifugare a 230 × g per 10 minuti.
- Con attenzione liquido decantare da tubi FACS. Conservare tutti i tubi in un recipiente coperto (preferibilmente su ghiaccio) per la successiva analisi FACS.
5. Flusso di acquisizione e analisi Citometro
- Calibrare il citofluorimetro utilizzando perline di riferimento.
- Verificare le impostazioni dello strumento:
- Utilizzando cellule di controllo senza macchia o controlli isotipo, regolare la posizione del gate linfocitario vitale (FSC vs SSC). Rimuovere l'auto-fluorescenza da tutti i canali di centraggio della popolazione (modificando le impostazioni di guadagno) al di sotto del primo decennio su ogni asse.
- Utilizzando solo i tubi di controllo del colore, gli eventi all'interno del centro quadranti corretta per ogni singolo colore (modificando le impostazioni di compensazione).
- Fare una regolazione fine delle impostazioni dello strumento utilizzando un tubo colorato con un tetramero irrilevante. In particolare le impostazioni per il canale di PE può essere necessario regolare perché spesso tetrameri macchia più luminosa del controllo degli anticorpi. Il tetramero irrilevante dovrebbe macchia <0,5% delle cellule CD4 +.
- Acquisire dati per ogni tubo
- Raccogliere eventi per ogni provetta e tubo controllo negativo
- Acquisire e salvare almeno 20.000 eventi per Analysys
- Analizzare i dati
- Dati importare file in software di analisi FACS (ad esempio il software CellQuest, WinMDI o FlowJo). Inizia la tua analisi utilizzando un tubo colorato con un tetramero irrilevante.
- Plot FSC vs SSC e disegnare un cancello intorno i linfociti dal vivo (Figura 1, pannello in alto a sinistra).
- CD4 complotto contro CD3 (gated per mostrare linfociti vivere solo) e disegnare cancelli tutto il CD3 + e CD4 + popolazioni (Figura 1 pannello in alto a destra).
- CD4 plot vs tetramero (gated per mostrare linfociti CD3 + solo) e impostare i confini quadrante in modo che i CD4 + tetramero + popolazione è inferiore allo 0,5% (Figura 1 pannello in basso a sinistra).
- Plot CD25 vs tetramero (gated per mostrare linfociti CD4 + solo) e impostare i confini quadrante in modo che la popolazione tetramero + CD25 + è inferiore allo 0,5% (Figura 1 pannello in basso a destra).
- Analizzare tutte le provette senza cambiare le porte.
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Figura 1. Rappresentante di controllo negativo risultati della colorazione tetramero. Il pannello in alto a sinistra mostra in avanti side scatter versi dispersione e la dimensione del gate dei linfociti (R1). Il pannello in alto a destra è recintato per R1 e mostra formica-CD4 contro anti-CD3 e il CD3 + (R2) e CD4 + (R3) cancelli. Il pannello in basso a sinistra è recintato per R2 e mostra anti-CD4 rispetto al tetramero. Il pannello in basso a destra è recintato per R3 e mostra anti-CD25 contro tetramero. I quadranti di entrambe le trame tetramero sono stati fissati al 0,5%.
6. Rappresentante Risultati
- Le cellule tetramero positivo dovrebbe essere una popolazione distinta tra le cellule CD4 + espanse (Figura 2).
- Cellule tetramero positivi sono di solito CD25 + CD4 e spesso elevata.
- In alcuni casi, una combinazione MHC / peptide può dare la colorazione di fondo (spesso causati da un peptide con scarsa solubilità). Colorazione di fondo quali possono essere differenziati da un vero positivo perché il "falso positivo" le cellule non sono un unico popolo distinto sia sul CD4 rispetto tetramero o il CD25 vs trame tetramero (Figura 3).
Figura 2. Rappresentante positivi risultati della colorazione tetramero. Il layout del pannello e la strategia di gating sono identici alla figura 1. Le cellule tetramero positive appaiono come un popolo distinto CD4 alta sulla anti-CD4 rispetto al pannello di tetramero e una distinta popolazione CD25 + sul anti-CD25 contro pannello tetramero.
Figura 3. Rappresentante "falsi positivi" risultati della colorazione tetramero. Il layout del pannello e la strategia di gating sono identici alla figura 1. L'anti-CD4 rispetto al pannello tetramero mostra una colorazione indistinta "mounded". L'anti-CD25 contro tetramero mostra anche una colorazione "mounded", senza alcuna chiara tendenza verso l'essere CD25 +.
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Discussion
Comprendere il ruolo delle cellule T CD4 + nel immunità è di fondamentale importanza. Tuttavia, CD4 + antigene specifico le cellule T possono essere difficili da individuare e isolare con metodi tradizionali. Al contrario, tetrameri MHC di classe II permette la visualizzazione diretta delle cellule T CD4 + con la specificità antigene desiderato. Questo video dimostra l'isolamento, la purificazione e l'amplificazione in vitro di cellule T CD4 + e la loro successiva visualizzazione con tetrameri. Classe II sono tetrameri proteina fluorescente coniugati composto solubile biotinilato classe II α / dimeri β coniugato fluorescente attorno ad un nucleo streptavidina marcata (Figura 4). I tetrameri utilizzato in questo video sono stati prodotti dal laboratorio Nucleo Teramer al Benaroya Research Institute utilizzando colture cellulari di insetto (1). Queste tetrameri sono preparati come mg / 0,5 ml soluzione e può essere conservato a 4 ° C per 6-18 mesi. Tetrameri non dovrebbe mai essere congelato, come gelo-disgelo insiste può togliere l'etichetta di PE lontano dal nucleo steptavidin. Classe II reagenti di colorazione può essere ottenuto da diverse fonti (tabella 1) e sono designati come tetrameri, "ultimers", e multimeri. Va notato che la procedura di test tetramero qui descritto è distinto dalle procedure utilizzate per la classe I tetrameri. Classe I tetramero colorazione è di solito ottimale a 4 ° C, mentre in classe II colorazione tetramero richiede in genere 37 ° C. Classe I tetrameri legano più strettamente alle cellule T di tetrameri Classe II per l'effetto più forte cooperativa di CD8 rispetto ai CD4. Il test tetramero qui descritto è efficace nel visualizzare cellule T specifiche per antigeni stranieri o di auto, ma la forza di interazione è intrinsecamente inferiore per antigeni self. Diverse varianti del test sono possibili. Per esempio, cellule T CD4 + può essere ulteriormente frazionato prima della stimolazione (popolazioni ad esempio, nella memoria e ingenuo), stimolato using una proteina intera o peptidi piscine (2), o vari trattamenti possono essere aggiunti ai diversi pozzetti per misurare la loro influenza sulla antigene risposta specifica. Dal momento che solo una parte di ogni bene è necessario per l'analisi tetramero, le cellule rimanenti possono colorate con tetramero per l'ordinamento o riservati per altri scopi. La configurazione per ogni singolo esperimento sarà dettata sia dalle caratteristiche del campione e dalla questione scientifica viene chiesto. Ai fini della progettazione è fondamentale conoscere il tipo HLA del donatore di sangue, perché questo influenzerà la epitopi utilizzati per l'espansione e detterà il tetramero corrispondente che deve essere utilizzato. La conoscenza dello stato di malattia o di immunizzazione può essere cruciale per l'interpretazione dei risultati. E 'importante mantenere con cura le cellule durante la fase di amplificazione, poiché le cellule malsane può dare risultati molto poveri. Inoltre, proprio apparecchio controlla l'installazione, gating e negativi sono di vitale importanza per ottenere risultati di alta qualità citometria a flusso.
Figura 4. Schematica di MHC di classe II tetramero. Il nucleo rosso rappresenta la streptavidina-PE molecola. Le estensioni di verde e nero rappresentano il MHC di classe II α / β dimeri. Il complesso si affianca l'interazione ad alta affinità tra biotina e streptavidina.
Tabella 1: Diverse fonti di reagenti di colorazione classe II
| Fonte tetramero | Tipo di prodotto | Indirizzo web |
| Beckman Coulter | Tetrameri | www.beckman.com |
| NIH tetramero Fondo | Tetrameri | www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core |
| Proimmune | Ultimers | www.proimmune.com |
| Benaroya Research Institute | Multimeri | www.benaroyaresearch.org |
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Acknowledgments
Ringraziamo Dick Foley e Leigh Kimball per il loro ruolo chiave nella ripresa e produzione video.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR international | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | Hyclone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond Scientific | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman Coulter Inc. | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR international | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR international | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalge Nunc international | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon BD | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD Biosciences | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
