Summary
Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.
Abstract
Complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II tetrâmeros permite a visualização direta do antígeno específico CD4 + células T por citometria de fluxo. Esse método se baseia na interação altamente específica entre peptídeo carregado MHC eo receptor de células T correspondente. Enquanto a afinidade de uma molécula MHC / peptídeo única é baixa, cross-linking complexos MHC / peptídeo com estreptavidina aumenta a avidez da interação, possibilitando a sua utilização como coloração reagentes. Por causa das freqüências relativamente baixas de células CD4 + T (~ 1 em 300.000 para uma especificidade única) este ensaio utiliza um passo de amplificação in vitro para aumentar o seu limiar de detecção. Células mononucleares são purificadas do sangue periférico por underlay Ficoll. CD4 + células são então separados por seleção negativa usando cocktail anticorpo biotinilado e anti-biotina marcada esferas magnéticas. Usando células aderentes a partir da fração de células CD4-células apresentadoras de antígenos como, células T CD4 + são expandidos em mídia pela adição de um peptídeo antigênico e IL-2. As células expandidas estão manchadas com o correspondente da classe II tetrâmero pela incubação a 37 C por uma hora e, posteriormente, coradas anticorpos de superfície, como anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Após a marcação, as células podem ser diretamente analisados por citometria de fluxo. As células positivas tetrâmero normalmente formam uma população distinta entre os CD4 + células expandidas. Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados. Porque o nível de coloração tetrâmero fundo pode variar, os resultados da coloração positiva deve ser sempre comparado com a coloração das células mesmo com um tetrâmero irrelevante. Múltiplas variações deste ensaio básicas são possíveis. Tetrâmero células positivas podem ser classificadas para a análise fenotípica ainda, a inclusão no ELISPOT ou ensaios de proliferação, ou outros ensaios secundários. Vários grupos também demonstraram co-coloração usando tetrâmeros e ou de citocinas anti-ou anti-FoxP3 anticorpos.
Protocol
1. Do sangue periférico mononuclear cela de isolamento (PBMC)
- Obter uma amostra de sangue - sangue deve ser coletado em seringas ou tubos de sangue e anti-coagulado com heparina (1:50 ratio) para prevenir a coagulação. Esperar um rendimento de cerca de 1 × 10 6 PBMC por mL de sangue - cerca de 40% dos quais serão CD4 positivos (CD4 +) células T.
- Alíquota do sangue em tubos cônicos de 50 mL, 25 mL por tubo. Se o sangue tem separado, misture suavemente antes de alíquotas para distribuir o plasma
- Adicionar PBS, elevando o volume total de 40 mL e underlay através da elaboração de 11 mL de Ficoll, inserindo no tubo de sangue, e com cuidado retirar a ajuda da pipeta pipeta. O Ficoll irá drenar lentamente para o fundo do tubo. Uma vez que o nível tem empatou, lentamente, remova a pipeta do tubo de sangue e descartar.
- Cap os tubos de sangue e passar para as latas Aerosolve. Feche as vasilhas e centrifugar a 900 × g por 20 minutos - sem freio. É fundamental que nenhum freio é aplicado no final desta rodada como a força de travagem vai perturbar a camada de células.
- Após a rodada, os PBMCs devem formar uma camada distinta em branco entre o plasma amarelo (acima) e Ficoll transparente (abaixo). Suavemente escumar camada de células brancas do sangue usando uma pipeta e transferir para novo tubo. Alguns plasma e Ficoll pode ser elaborado com a PBMCs, mas evitar a elaboração de qualquer um dos camada de células vermelhas. Normalmente, dois tubos de sangue podem ser combinados em um tubo de células nesta etapa para aumentar o tamanho da pelota.
- Adicionar PBS, elevando o volume total de 50 mL e centrifugar a 500 × g por 15 minutos - de freio baixo em vasilhas aerosolve.
- Aspirar líquido utilizando uma pipeta Pasteur, tomando cuidado para não perturbar o pellet
- Tratar com tampão hemolítica adicionando 5-6 mL de cada tubo e misturar delicadamente para remover coágulos. Incubar por não mais que 5 minutos.
- Adicionar PBS, elevando o volume total de 50 mL e centrifugar a 230 × g por 10 minutos - de freio baixo. Vasilhas Aerosolve não são mais necessários para esses spins mais lento.
- Lave duas vezes: Aspirar líquido utilizando uma pipeta Pasteur, preencha tubo com PBS e centrifugar a 230 × g por 10 minutos.
- Antes da etapa de lavagem final, retire uma alíquota de re-suspensão de células, diluir com azul de tripano, e contar com um hemocitômetro. Esta contagem de células vai ditar os volumes de reagentes utilizados na etapa de separação de células T.
2. CD4 + T * separação de células
- Aspirar líquidos e adicionar tampão de corrida para trazer o volume total de até 40 uL por 10 milhões de células. Normalmente, isso requer 30 uL de tampão mais o volume de pelotas residual.
- Transferir este volume para um tubo cônico de 15 mL.
- Adicionar cocktail anticorpo do kit de isolamento CD4 - 10 uL por 10 milhões de células, tubo de tampa, e colocar no gelo por 10 minutos
- Retire o tubo do gelo, retire a tampa e adicionar 30 uL de tampão de corrida por 10 milhões de células
- Adicionar esferas magnéticas do kit de isolamento CD4 - 20 uL por 10 milhões de células, tubo de tampa, e colocar no gelo por 15 minutos
- Adicionar dez volumes de tampão de corrida para lavar e centrifugar a 230 × g por 10 minutos.
- Durante a rodada, configurar o ímã e 5 mL em tubo de polipropileno seu espaço de trabalho
- Aspirar líquido de pellet celular, adicione 2 mL de tampão execução e remover pedaços usando uma pipeta
- Usando a mesma pipeta de transferência, a transferência de células dentro do tubo de 5 mL e incubar no ímã para 15 minutos
- Decantar com precaução o CD4 + fração de células em um tubo de 15 mL marcada pelo ímã invertendo o esvaziamento e todos, mas a última gota
- Acrescentar ainda 2 ml de tampão de corrida para o tubo de 5 mL e retire do ímã
- Gentilmente lavar o CD4-células fora dos lados do tubo e transferir para um tubo de 15 mL marcada
- Adicionar 2 mL médio de células T a cada tubo, remova alíquotas para contagem de células e centrifugar a 230 × g por 10 minutos.
- Diluir alíquotas celular com azul de tripano e contar com um hemocitômetro. Estas contagens de células vai ditar o número de poços utilizados para a etapa de expansão da cultura.
* Alternativamente, MACS colunas e contas (Miltenyi Biotec), o separador de células AutoMACS (Miltenyi Biotec), ou Robosep separador de células (Cell Stem Technologies) pode ser usado de acordo com instruções fabrica no lugar de passos 2,2-2,11.
3. Cultivo in vitro de Expansão
- Aspirar o líquido do CD4 + e de células CD4 e pellets, com base na contagem de células, adicionar meios de cultura (tipicamente 3 milhões CD4 + células por mL e 10 milhões de CD4-células por mL funciona bem para criar a cultura). A cultura de expansão requer 3-5000000 CD4-células por poço e 2-3000000 CD4 + células por poço em um volume total de 1 mL da cultura em media uma placa de cultura de 48 também. Normalmente, células CD4 + estão limitando a população
- Se desejar, irradiar os CD4-células (5000 Rad s). Alíquota CD4-células para o número apropriado de poços em um prato bem, adicionando 48 mL a cada 300-500. Coloque a placa em uma incubadora de 37 ° C por 1 hora. O aderente CD4-células servirão como células apresentadoras de antígenos na cultura de expansão.
- Remova a placa da incubadora.
- Lavar os poços por adição de 500 uL de mídia fresco e cuidado pipetando para cima e para baixo 12-20 vezes usando uma pipeta de transferência e remoção de todo o líquido. Esta lavagem vai deixar para trás uma camada de células aderentes antígeno apresentando.
- Quando a lavagem estiver completa, adicione mídia apenas o suficiente para molhar a parte inferior de cada bem (cerca de 100 uL) - caso contrário, as células aderentes vai secar
- Adicionar 2-3000000 células CD4 + a cada poço. Se necessário, adicione mídia adicional para trazer o volume total em cada poço até 1 mL.
- Adicione o peptídeo desejado para cada poço. A concentração típica para a estimulação é de 10 ug / mL final.
- Colocar a placa em uma incubadora de 37 ° C por 7 dias.
- Após 7 dias, adicionar 50 uL de Hemogen IL-2 (ou equivalente, como recombinante IL-2, 10 IU / mL) a cada poço.
- Em cada dia subseqüente, monitorar o crescimento de células usando um microscópio. Alimentar poços que ainda não são confluentes, removendo metade dos media, acrescentando novas mídias e 50 uL de IL-2. Dividir poços confluentes pela ressuspensão das células, movendo-se metade das células para um poço vazio, agregando novas mídias e 50 uL de IL-2. Retorno células a incubadora.
- As células expansão estará pronto para tetrâmero após 13-15 dias de cultura.
4. Visualizando células T através da coloração tetrâmero
- Comprar ou montar tetrâmeros para combinar com as combinações de peptídeo / MHC que correspondem à CD4 + estimulou as células T (veja a discussão de fontes de reagentes tetrâmero). Tetrâmeros devem ser ~ 0,5 mg / mL.
- Retire a placa da incubadora
- Cuidadosamente a tirar metade dos meios de comunicação de cada poço
- Transferir uma alíquota de células de cada poço - geralmente 75 mL ou cerca de 50 mil células - em um tubo de poliestireno 5 mL FACS
- Adicionar tetrâmero - tipicamente mL 1 por 50 volume de mL total - e colocar em 37 ° C incubadora de 1-2 horas. Também é aconselhável a manchar uma alíquota de segundo de células de cada poço com um tetrâmero incompatíveis como controle negativo.
- Células etiqueta com anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD25 anticorpos adicionando 30-10 mL de cada anticorpo. Marcadores de anticorpos adicionais ou alternativos podem ser usados. No entanto, não use anticorpos PE rotulados desde que este canal deve ser reservado para o tetrâmeros. Neste momento, também único rótulo controles de cor ou isotipo usando células extra.
- Células anticorpo rotulado incubar por 15-30 minutos em gelo ou a 4 ° C.
- Lavar cada tubo com 0,5 a 2 mL tampão de corrida e centrifugar a 230 × g por 10 minutos.
- Cuidadosamente decantar líquidos a partir de tubos FACS. Armazenar todos os tubos em um recipiente coberto (de preferência no gelo) para análise FACS subseqüentes.
5. Aquisição e Análise de fluxo citómetro
- Calibrar O citómetro usando pérolas de referência.
- Verifique as configurações do instrumento:
- Usando células controle imaculada ou controles isotipo, ajustar a localização da porta de linfócitos viáveis (FSC versus SSC). Remover auto-fluorescência de todos os canais pela centralização da população (alterando as configurações ganho) abaixo da primeira década em cada eixo.
- Usando tubos de cor única de controle, centro de eventos dentro da quadrantes correto para cada cor (alterando as configurações de compensação).
- Fazer um ajuste fino das configurações do instrumento usando um tubo manchado com um tetrâmero irrelevante. Em configurações específicas para o canal de PE podem precisar de ajustes, porque muitas vezes tetrâmeros mancha mais brilhante do que o controle de anticorpos. O tetrâmero irrelevantes devem mancha <0,5% das células CD4 +.
- Aquisição de dados para cada tubo
- Coletar eventos para cada tubo de amostra e tubo de controle negativo
- Adquirir e salvar pelo menos 20.000 eventos para Analysys
- Analisar os dados
- Importar arquivos de dados em FACS software de análise (por exemplo, software CellQuest, WinMDI, ou programa FlowJo). Comece sua análise através de um tubo manchado usando um tetrâmero irrelevante.
- Plot FSC versus SSC e desenhar uma porta em torno dos linfócitos ao vivo (Figura 1, o painel superior esquerdo).
- CD4 trama contra CD3 (linfócitos gated para mostrar ao vivo apenas) e desenhar portas em todo o CD3 + e CD4 + populações (Figura 1 painel superior direito).
- CD4 enredo vs tetrâmero (gated para mostrar linfócitos CD3 + somente) e estabelecer os limites para que o quadrante CD4 + + tetrâmero população é menos de 0,5% (Figura 1 painel inferior esquerdo).
- Plot CD25 versus tetrâmero (gated para mostrar linfócitos CD4 + apenas) e definir os limites do quadrante de modo que o CD25 + + tetrâmero população é inferior a 0,5% (Figura 1 painel inferior direito).
- Analisar todos os tubos de amostra, sem alterar as portas.
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Figura 1. Representante controlo negativo resultados de coloração tetrâmero. O painel superior esquerdo mostra a frente scatter scatter lado versos eo portão tamanho de linfócitos (R1). O painel superior direito é fechado para R1 e mostra ant-CD4 versus anti-CD3 e CD3 + (R2) e CD4 + (R3) portões. O painel inferior esquerdo é fechado para R2 e shows anti-CD4 contra tetrâmero. O painel inferior direito é fechado para R3 e shows anti-CD25 contra tetrâmero. Os quadrantes para ambos os lotes tetrâmero foram ajustados para 0,5%.
6. Resultados representante
- As células tetrâmero positivo deve ser uma população distinta entre as células CD4 + expandido (Figura 2).
- Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados.
- Em alguns casos, uma combinação MHC / peptídeo pode dar coloração de fundo (geralmente causadas por um peptídeo com baixa solubilidade). Coloração de fundo como pode ser diferenciado de um verdadeiro positivo porque o "falso positivo" células não são uma única população distinta em ambos os CD4 vs tetrâmero ou o CD25 versus parcelas tetrâmero (Figura 3).
Figura 2. Coloração resultados positivos Representante tetrâmero. O layout do painel e da estratégia de propagação são idênticos a Figura 1. As células tetrâmero positivos aparecem como uma população distinta CD4 elevado na CD4 anti-versus tetrâmero painel e uma distinta população CD25 + sobre o anti-CD25 contra painel de tetrâmero.
Figura 3. Representante "falsos positivos" os resultados da coloração tetrâmero. O layout do painel e da estratégia de propagação são idênticos a Figura 1. O CD4 anti-versus painel mostra um tetrâmero coloração indistinta "mounded". O anti-CD25 contra tetrâmero mostra também uma coloração "mounded", sem tendência clara em direção a ser CD25 +.
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Discussion
Compreensão do papel das células T CD4 + na imunidade é de fundamental importância. No entanto, CD4 + antígeno específico das células T pode ser difícil de detectar e isolar usando métodos tradicionais. Em contraste, tetrâmeros de MHC classe II permite a visualização direta de células CD4 + T com a especificidade do antígeno desejado. Este vídeo demonstra o isolamento, purificação e amplificação in vitro de células CD4 + T e sua visualização posterior usando tetrâmeros. Tetrâmeros de classe II são conjugados proteína fluorescente solúvel biotinilado consistindo de classe II α / β dímeros conjugados em torno de um núcleo fluorescentes estreptavidina marcada (Figura 4). Os tetrâmeros utilizado neste vídeo foram produzidos pelo Laboratório de Núcleo de Pesquisa em Teramer Benaroya Instituto utilizando culturas de células de inseto (1). Esses tetrâmeros são preparados como solução de 0,5 mg / mL e pode ser armazenado a 4 ° C por 6-18 meses. Tetrâmeros nunca devem ser congeladas, como congelamento e descongelamento tensões podem retirar o rótulo PE longe do núcleo steptavidin. Reagentes de coloração de classe II podem ser obtidos de diversas fontes (Tabela 1) e são designados como tetrâmeros ", ultimers", e multímeros. Note-se que o procedimento de ensaio tetrâmero descrito aqui é distinta da dos procedimentos utilizados para a classe I tetrâmeros. Classe I coloração tetrâmero normalmente é ideal a 4 ° C, enquanto a classe II coloração tetrâmero geralmente requer 37 ° C. Tetrâmeros classe I ligar mais firmemente às células T que tetrâmeros Classe II por causa do forte efeito cooperativo de CD8 em relação ao CD4. O ensaio aqui descrito tetrâmero é eficaz na visualização de células T específicos para antígenos estranhos ou self, mas a força de interação é inerentemente mais baixos para os antígenos próprios. Diversas variações do ensaio são possíveis. Por exemplo, células T CD4 + podem ser ainda mais fracionada anterior à estimulação (populações por exemplo, na memória e naïve), estimulou o uso de uma proteína integral ou peptídeo piscinas (2), ou vários tratamentos podem ser adicionados aos poços diferentes para medir sua influência sobre o antígeno resposta específica. Uma vez que apenas uma porção de cada bem é necessário para a análise tetrâmero, as células restantes podem corados com tetrâmero para classificação ou reservados para outros fins. A configuração para cada experimento individual será ditada tanto pelas características da amostra e com a questão científica que está sendo perguntado. Para fins de projeto é fundamental para saber o tipo de HLA do doador de sangue, porque isso irá influenciar os epítopos utilizados para a expansão e irá ditar o tetrâmero correspondente que deve ser usado. Conhecimento do estado da doença ou imunização também pode ser crucial para a interpretação dos resultados. É importante manter cuidadosamente as células durante a etapa de amplificação, uma vez que as células saudáveis pode dar resultados muito pobres. Além disso, controles da máquina adequada gating setup, e negativos são de vital importância para a obtenção de resultados de alta qualidade citometria de fluxo.
Figura 4. Esquemática do MHC classe II tetrâmero. O núcleo vermelho representa a molécula de estreptavidina-PE. As extensões de verde e preto representam o MHC classe II α / β dímeros. O complexo é unido pela interação entre a alta afinidade biotina e estreptavidina.
Tabela 1: Várias fontes de reagentes de coloração classe II
| Fonte tetrâmero | Tipo de produto | Endereço Web |
| Beckman Coulter | Tetrâmeros | www.beckman.com |
| NIH Facility tetrâmero | Tetrâmeros | www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core |
| Proimmune | Ultimers | www.proimmune.com |
| Benaroya Research Institute | Multímeros | www.benaroyaresearch.org |
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Acknowledgments
Agradecemos a Dick Foley e Leigh Kimball para seus papéis-chave na filmagem e produção de vídeo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR international | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | Hyclone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond Scientific | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman Coulter Inc. | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR international | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR international | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalge Nunc international | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon BD | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD Biosciences | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
