使用MHC II类四聚体可视化抗原特异性CD4+ T细胞

摘要

本实验展示了从全外周血中纯化并体外扩增抗原特异性CD4+ T细胞，以及利用MHC II类四聚体对其进行可视化检测的方法。四聚体技术能够直接可视化具有单一抗原特性和明确MHC II类限制性的T细胞。

摘要

主要组织相容性复合体（MHC）II类四聚体可实现通过流式细胞术直接可视化抗原特异性的CD4+ T细胞。该方法依赖于肽段负载的MHC分子与其相应T细胞受体之间的高度特异性相互作用。尽管单个MHC/肽段分子的亲和力较低，但通过链霉亲和素交联MHC/肽段复合物可增强相互作用的亲合力，从而使其可用作染色试剂。由于CD4+ T细胞的频率相对较低（单个特异性约1/300,000），该检测方法采用体外扩增步骤以提高其检测阈值。单个核细胞通过Ficoll密度梯度离心法从外周血中纯化获得，随后利用生物素标记的抗体混合物及抗生物素包被的磁珠通过阴性选择法分离CD4+细胞。将CD4-细胞组分中的贴壁细胞作为抗原呈递细胞，通过在培养基中加入抗原肽和IL-2对CD4+ T细胞进行扩增。扩增后的细胞与相应的II类四聚体在37°C孵育1小时进行染色，随后使用表面抗体（如抗-CD4、抗-CD3和抗-CD25）进行二次染色。标记完成后，细胞可直接进行流式细胞术分析。四聚体阳性细胞通常在扩增后的CD4+细胞中形成一个明显独立的细胞群，且通常为CD25+，常表现为CD4高表达。由于背景四聚体染色水平可能有所差异，阳性染色结果应始终与同一细胞使用无关四聚体的染色结果进行比较。该基本检测方法存在多种变体。四聚体阳性细胞可被分选用于进一步的表型分析，或用于ELISPOT、增殖实验等其他下游功能检测。已有多个研究团队成功实现了四聚体与抗细胞因子抗体或抗-FoxP3抗体的共染色。

方案

1. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离

1. 采集血样——应使用注射器或采血管收集血液，并以肝素（1:50 比例）抗凝，防止血液凝固。预计每毫升血液可获得约 1×10⁶ 个外周血单个核细胞（PBMC），其中约 40% 为 CD4 阳性（CD4+）T 细胞。
2. 将血液分装至 50 mL 圆锥形离心管中，每管 25 mL。若血液已发生分层，分装前应轻柔混匀，以均匀分布血浆。
3. 加入 PBS，使总体积达到 40 mL，然后通过吸取 11 mL Ficoll，插入血样管中，小心将移液器辅助装置从移液管上取下，使 Ficoll 缓慢流入管底。待液面平衡后，缓慢将移液管从血样管中取出并弃去。
4. 盖紧血样管，放入 Aerosolve 离心罐中。牢固封闭离心罐，以 900×g 离心 20 分钟——不使用刹车。此步骤结束时严禁使用刹车，因为制动力会扰动细胞分层。
5. 离心后，PBMC 应在上层黄色血浆与下层透明 Ficoll 之间形成明显的白色层。使用转移移液管轻柔吸取白细胞层，并转移至新管中。PBMC 中可能混入少量血浆和 Ficoll，但应避免吸取红细胞层。通常在此步骤可将两管血液样本合并至同一细胞管中，以增大沉淀体积。
6. 加入 PBS，使总体积达到 50 mL，以 500×g 离心 15 分钟——在 Aerosolve 离心罐中使用低刹车。
7. 使用巴斯德移液管吸除上清液，注意不要扰动沉淀。

讨论

了解 CD4+ T 细胞在免疫中的作用具有根本性的重要意义。然而，使用传统方法检测和分离抗原特异性的 CD4+ T 细胞可能较为困难。相比之下，MHC II 类四聚体（tetramer）能够直接可视化具有目标抗原特异性的 CD4+ T 细胞。本视频展示了 CD4+ T 细胞的分离、纯化和体外扩增，以及随后使用四聚体进行检测的流程。II 类四聚体是由可溶性生物素化的 II 类 α/β 二聚体围绕荧光标记的链霉亲和素核心结合而成的荧光蛋白偶联物（图 4）。本视频中使用的四聚体由贝纳罗亚研究所（Benaroya Research Institute）的四聚体核心实验室利用昆虫细胞培养系统制备（1）。这些四聚体以 0.5 mg/mL 的溶液形式保存，可在 4°C 下储存 6 至 18 个月。四聚体切勿冷冻，因为冻融过程可能使藻红蛋白（PE）标记从链霉亲和素核心上脱落。II 类染色试剂可从多个来源获得（表 1），并被命名为四聚体（tetramers）、“ultimers” 和多聚体（multimers）。需要注意的是，此处描述的四聚体检测方法与 I 类四聚体的检测流程不同。I 类四聚体染色通常在 4°C 下效果最佳，而 II 类四聚体染色通常需要.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
II级层流生物安全柜	设备	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	或同类产品
50 mL 圆锥形离心管	设备	VWR international	47747-182	或同类产品
1× PBS（无Ca/Mg）	试剂	Hyclone	SH30028.02	或同类产品
Ficoll-paque PLUS	试剂	GE Healthcare	17-1440-03	需用铝箔包裹避光
Pipet Aid XP	设备	Drummond Scientific	4-000-101	或同类产品
10 mL 移液管	设备	Corning	CLS4492	或同类产品
Aerosolve 样品管	设备	Beckman Coulter Inc.	359481	配50 mL 插件
离心机	设备	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	或同类产品
移液器吸头	设备	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	或同类产品
巴斯德移液管	设备	VWR international	14672-200	或同类产品
溶血缓冲液	试剂	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl，1.0 g/L NaHCO3，0.04 g/L 乙二胺四乙酸二钠
台盼蓝	试剂	Sigma-Aldrich	T6146	PBS中0.2%
血细胞计数板	设备	VWR international	15170-208
15 mL 圆锥形离心管	设备	VWR international	05-527-90	或同类产品
运行缓冲液	试剂	N/A	N/A	PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA
MACS CD4+ T细胞分离试剂盒II	试剂	Miltenyi Biotec	130-091-155	或同类产品
EasySep® 磁铁	设备	Stem Cell Technologies	18000
5 mL 聚丙烯管	设备	Falcon BD	352063
RPMI 1640	试剂	Invitrogen	22400-089	含25 mM HEPES
混合人血清	试剂	N/A	N/A	来自健康供体，经热灭活并过滤
青霉素-链霉素（Pen Strep）	试剂	Invitrogen	1570-063	或同类产品
500 mL 0.22 微米瓶顶过滤器	设备	Nalge Nunc international	595-3320	或同类产品
48孔板	设备	Costar	3548	或同类产品
37°C CO2 培养箱	设备	Sanyo	MCO-18AIC	或同类产品
20 mg/mL 合成多肽	试剂	N/A	N/A	由任意多肽供应商定制合成
5 mL FACS 管	设备	Falcon BD	352008	聚苯乙烯材质
多肽负载的II类四聚体（如所述）	试剂	N/A	N/A	由BRI四聚体核心制备
抗CD3抗体	试剂	BD Biosciences	347344	或同类产品
抗CD4抗体	试剂	eBioscience	17-0049-73	或同类产品
抗CD25抗体	试剂	eBioscience	11-0259-73	或同类产品
Facs Calibur 流式细胞仪	设备	BD Biosciences	342975	或同类产品