Summary
Este procedimiento muestra la purificación y la expansión in vitro de las células CD4 + antígeno específico de células T de sangre periférica y su visualización utilizando tetrámeros de MHC de clase II. Tetrámeros permitir la visualización directa de las células T con una especificidad de antígeno único y definido restricción MHC de clase II.
Abstract
Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II tetrámeros permite la visualización directa de las células CD4 + antígeno específico de células T por citometría de flujo. Este método se basa en la interacción altamente específica entre el péptido cargado MHC y el receptor de células T correspondientes. Mientras que la afinidad de un único MHC / péptido molécula es baja, el entrecruzamiento complejos MHC / péptido con estreptavidina aumenta la avidez de la interacción, lo que permite su uso como reactivos de coloración. Debido a las frecuencias relativamente bajo de células CD4 + T (~ 1 en 300.000 para una sola especificidad), este ensayo utiliza un paso de amplificación in vitro para aumentar su umbral de detección. Las células mononucleares se purifican a partir de sangre periférica por subyace Ficoll. Las células CD4 + se separan por selección negativa con un cóctel de anticuerpos con biotina y anti-biotina marcada partículas magnéticas. El uso de células adherentes de la fracción de células CD4 en las células presentadoras de antígeno, células T CD4 + se amplió en los medios de comunicación mediante la adición de un péptido antigénico e IL-2. Las células se expanden son manchadas con la correspondiente clase II tetrámero mediante la incubación a 37 ° C durante una hora y posteriormente teñidos con anticuerpos de superficie, tales como anti-CD4, anti-CD3 y anti-CD25. Después de etiquetado, las células pueden ser directamente analizadas por citometría de flujo. Las células tetrámero positivo generalmente se forman una población distinta entre los CD4 + células ampliado. Tetrámero células positivas suelen ser CD25 + y CD4 alta frecuencia. Debido a que el nivel de tinción de fondo tetrámero puede variar, los resultados positivos de tinción debe estar siempre en comparación con la tinción de las mismas células con un tetrámero irrelevante. Múltiples variaciones de este ensayo básicos son posibles. Tetrámero células positivas pueden ser clasificados para su posterior análisis fenotípico, la inclusión en ELISPOT o los ensayos de proliferación, u otras pruebas secundarias. Varios grupos han demostrado también co-tinción con tetrámeros y, o bien anti-citoquinas y anticuerpos anti-FoxP3.
Protocol
1. Sangre periférica de células mononucleares (PBMC) de aislamiento
- Obtener una muestra de sangre - la sangre deben ser recogidas en jeringas o tubos de sangre y anticoagulada con heparina (1:50 ratio) para prevenir la coagulación. Esperar un rendimiento de alrededor de 1 × 10 6 PBMC por ml de sangre - aproximadamente el 40% de los cuales se CD4 positivos (CD4 +) las células T.
- Alícuota de la sangre en tubos de 50 ml cónico de 25 ml por tubo. Si la sangre se ha separado, mezcle suavemente antes de alícuotas para la distribución del plasma
- Añadir PBS, con lo que el volumen total de 40 ml y subyace en la elaboración de 11 ml de Ficoll, la inserción en el tubo de sangre y, con cuidado de retirar la ayuda de una pipeta la pipeta. El Ficoll lentamente de drenaje en el fondo del tubo. Una vez que el nivel se ha igualado, retire lentamente la pipeta del tubo de sangre y desechar.
- Tape los tubos de sangre y pasar a los botes Aerosolve. Cierre bien los recipientes y se centrifuga a 900 × g durante 20 minutos - sin freno. Es muy importante que no freno se aplica al final de este giro en la fuerza de frenado se perturbe la capa de células.
- Después de la vuelta, el PBMCs debe formar una capa distinta en blanco entre el plasma amarillo (arriba) y Ficoll transparente (abajo). Suavemente quítele la capa de glóbulos blancos con una pipeta de transferencia y traslado al nuevo tubo. Algunos de plasma y Ficoll puede ser elaborado con la PBMCs, pero no llamar a ninguno de la capa de células rojas. Suele ser de dos tubos de sangre se pueden combinar en un tubo de células en este paso para aumentar el tamaño de las pastillas.
- Añadir PBS, con lo que el volumen total de 50 ml y centrifugar a 500 xg durante 15 minutos - de frenos baja en botes aerosolve.
- Aspirar el contenido con una pipeta Pasteur, con cuidado de no perturbar el sedimento
- Tratar con tampón hemolítica mediante la adición de 6.5 ml a cada tubo y mezclar suavemente para eliminar grumos. Incubar durante no más de 5 minutos.
- Añadir PBS, con lo que el volumen total de 50 ml y centrifugar a 230 × g durante 10 minutos - de frenos baja. Botes Aerosolve ya no son necesarios para estos giros más lentos.
- Lavar dos veces: líquido aspirado con una pipeta Pasteur, llenar el tubo con PBS y centrifugar a 230 g durante 10 minutos.
- Antes de la etapa de lavado final, retirar una alícuota de volver a suspender las células, diluir con azul de tripano, y contar con un hemocitómetro. Este recuento de células determinará el volumen de reactivo utilizado en la etapa de separación de células T.
2. De células CD4 + T * separación
- Aspirar el contenido y añadir tampón de que el volumen total de hasta 40 uL por 10 millones de células. Por lo general, esto requiere de 30 uL de buffer, más el volumen residual de pellets.
- La transferencia de este volumen a un tubo cónico de 15 ml.
- Añadir un cóctel de anticuerpos de los kit de aislamiento de células CD4 - 10 uL por 10 millones de células, el tubo de la tapa y colocar en hielo durante 10 minutos
- Retire el tubo de hielo, retire la tapa y agregar 30 uL de funcionamiento de amortiguación por 10 millones de células
- Añadir partículas magnéticas en el kit de aislamiento de células CD4 - 20 uL por 10 millones de células, el tubo de la tapa y colocar en hielo durante 15 minutos
- Añadir diez volúmenes de funcionamiento de amortiguación para lavar y centrifugar a 230 g durante 10 minutos.
- Durante el giro, coloque el imán y el tubo de 5 ml de polipropileno en su espacio de trabajo
- Aspirar el contenido de sedimento de células, añadir 2 ml de tampón de funcionamiento y eliminar grupos utilizando una pipeta de transferencia
- Usando la pipeta de transferencia misma, la transferencia de células en el tubo de 5 ml y se incuba en el imán durante 15 minutos
- Decantar cuidadosamente el recuento de CD4 + fracción de células en un tubo de 15 ml marcada por la inversión del imán y el vaciado de todos, pero la última gota
- Añadir otros 2 ml de funcionamiento de amortiguación en el tubo de 5 ml y retirar del imán
- Enjuague suavemente las células CD4-células de los lados del tubo y la transferencia a un tubo de 15 ml marca
- Añadir 2 ml de medio de las células T a cada tubo, retire alícuotas para el recuento de células y se centrifuga a 230 × g durante 10 minutos.
- Diluir alícuotas de células con azul tripán y contar con un hemocitómetro. Estos recuentos de células determinará el número de pozos utilizados para el paso de la cultura de expansión.
* Por otra parte, las columnas de MACS y los granos (Miltenyi Biotec), el separador celular AutoMACS (Miltenyi Biotec), o un separador de células Robosep (Tecnologías de células madre) se puede utilizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante en lugar de los pasos 2,2 hasta 2,11.
3. En la cultura de expansión in vitro
- Aspirar el contenido de las células CD4 + y CD4-células pellets y, en base a los recuentos de células, añadir los medios de cultivo (por lo general 3 millones de células CD4 + por ml y 10 millones de células CD4-células por ml funciona bien para la creación de la cultura). La cultura de expansión requiere 3-5 million CD4-células por pocillo y 2-3 million CD4 + células por pocillo en un volumen total de 1 ml de medio cultivo en una placa de cultivo de 48 también. Normalmente, las células CD4 + son la población límite
- Si lo desea, irradian las células CD4-células (5000 Rad s). Alícuota de células CD4 en la cantidad adecuada de los pozos de una placa de 48 y mediante la adición de 300 a 500 l de cada uno. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 1 hora. El adherente células CD4-servirá como células presentadoras de antígeno en la cultura de expansión.
- Retirar la placa de la incubadora.
- Lavar los pocillos añadiendo 500 l de medio fresco y suavemente pipeteando arriba y abajo 12-20 veces usando una pipeta de transferencia y la eliminación de todo el líquido. Este lavado se dejan atrás una capa de células adherentes presentar antígeno.
- Cuando la limpieza se completa, agregar los medios de comunicación sólo lo suficiente para mojar la parte inferior de cada bien (alrededor de 100 uL) - de lo contrario las células adherentes se seca
- Añadir 2-3 million células CD4 + a cada pocillo. Si es necesario, añadir medios adicionales para llevar el volumen total en cada pozo de hasta 1 ml.
- Añadir el péptido deseado a cada pocillo. La concentración típica de estimulación es de 10 ug / ml final.
- Coloque la placa en una incubadora a 37 ° C durante 7 días.
- Después de 7 días, se añaden 50 uL de Hemogen IL-2 (o su equivalente, como la IL-2, 10 UI / mL) a cada pocillo.
- En cada día subsiguiente, controlar el crecimiento de células utilizando un microscopio. Alimentar a los pozos que todavía no están confluentes mediante la eliminación de la mitad de los medios de comunicación, añadiendo medio fresco y 50 uL de IL-2. Dividir pozos confluentes por resuspensión de las células, pasando la mitad de las células de un pozo vacío, la adición de medio fresco y 50 uL de IL-2. Volver a las células de la incubadora.
- Las células de expansión estará listo para el tetrámero después de 13-15 días de cultivo.
4. Visualizar las células T mediante la tinción tetrámero
- Compra o montar tetrámeros para que coincida con las combinaciones de péptido / MHC que coinciden con los CD4 + células T estimuladas (ver la discusión de las fuentes de reactivos tetrámero). Tetrámeros debe ser ~ 0,5 mg / ml de solución.
- Retire la placa de la incubadora
- Con cuidado, extraiga la mitad de los medios de comunicación de cada pozo
- Pasar una alícuota de las células de cada pocillo - típicamente 75 l, o sobre las células 50.000 - en un 5 ml de poliestireno FACS tubo
- Añadir tetrámero - típicamente uno por cada 50 l de volumen total de l - y en 37 ° C incubadora durante 1-2 horas. También es recomendable para teñir una segunda alícuota de las células de cada pocillo con un tetrámero coincidentes como control negativo.
- Las células de la etiqueta con anti-CD3, anti-CD4 y anticuerpos anti-CD25 mediante la adición de 3.10 L de cada uno de anticuerpos. Marcadores de anticuerpos adicionales o alternativos pueden ser utilizados. Sin embargo, no use los anticuerpos etiquetados PE ya que este canal debe ser reservado para los tetrámeros. En este momento, también sola etiqueta controles de color o isotipo con células extra.
- Se incuban las células anticuerpo marcado durante 15-30 minutos en hielo oa 4 º C.
- Lave cada tubo con 0,5 a 2 ml funcionamiento de amortiguación y se centrifuga a 230 × g durante 10 minutos.
- Cuidado de los tubos de líquido se decanta FACS. Guarde todos los tubos en un recipiente con tapa (de preferencia en el hielo) para el análisis de FACS posteriores.
5. Flujo de Adquisición y Análisis de citómetro
- Calibrar el citómetro de flujo utilizando cuentas de referencia.
- Compruebe la configuración del instrumento:
- El uso de células teñidas de control o los controles de isotipo, ajustar la ubicación de la puerta de linfocitos viables (FSC frente a SSC). Quitar autofluorescencia de todos los canales, centrando la población (al cambiar los ajustes de ganancia) por debajo de la primera década en cada eje.
- Usando solo los tubos de control de color, centro de eventos dentro de los cuadrantes correcta para cada color (cambiando la configuración de compensación).
- Hacer un ajuste fino de la configuración del instrumento mediante un tubo de teñido con un tetrámero irrelevante. En situaciones particulares para el canal de PE puede necesitar un ajuste, porque a menudo tetrámeros mancha brillante que el control del anticuerpo. El tetrámero irrelevante que la mancha <0,5% de las células CD4 +.
- Adquisición de datos para cada tubo
- Recoger los sucesos de cada tubo de muestra y el tubo de control negativo
- Adquirir y ahorrar por lo menos 20.000 eventos de Analysys
- Analizar los datos
- Archivos de datos de importación en el software de análisis FACS (por ejemplo, software CellQuest, WinMDI o FlowJo). Iniciar su análisis con un tubo manchado con un tetrámero irrelevante.
- Parcela FSC frente a SSC y dibujar una puerta alrededor de los linfocitos en directo (Figura 1, panel superior izquierdo).
- CD4 complot contra CD3 (linfocitos cerrada para mostrar en vivo solamente) y sacar las puertas de todo el + CD3 y CD4 + poblaciones (Figura 1 panel superior derecho).
- CD4 complot vs tetrámero (cerrada para mostrar linfocitos CD3 + solamente) y establecer los límites del cuadrante para que los CD4 + + Tetramer población es menor de 0,5% (Figura 1 panel inferior izquierdo).
- Parcela CD25 vs tetrámero (cerrada para mostrar sólo los linfocitos CD4 +) y establecer los límites del cuadrante para que el CD25 + + Tetramer población es inferior al 0,5% (Figura 1 panel inferior derecho).
- Analizar todos los tubos de muestra sin necesidad de cambiar las puertas.
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Figura 1. Representante de control negativo resultados de la tinción tetramer. El panel superior izquierdo muestra hacia adelante dispersión dispersión lateral versos y la puerta de tamaño de los linfocitos (R1). El panel superior derecho está cerrada para la R1 y la muestra de hormigas-CD4 en comparación con anti-CD3 y CD3 + (R2) y CD4 + (R3) puertas. El panel inferior izquierdo está cerrado por R2 y programas de anti-CD4 en comparación con tetrámero. El panel inferior derecho está cerrada para la R3 y programas de anti-CD25 en comparación con tetrámero. Los cuadrantes de ambas parcelas tetrámero se establecieron en 0,5%.
6. Resultados representante
- Las células tetrámero positivo debe ser una población distinta entre los CD4 + células ampliado (Figura 2).
- Tetrámero células positivas suelen ser CD25 + y CD4 alta frecuencia.
- En algunos casos, una combinación de MHC / péptido puede dar a la tinción de fondo (a menudo causada por un péptido con una mala solubilidad). Tinción de fondo, se puede diferenciar de un verdadero positivo, porque los "falsos positivos", las células no son distintas de una misma población ya sea en el frente Tetramer CD4 o la CD25 vs parcelas tetrámero (Figura 3).
Figura 2. Representante positivos resultados de la tinción tetramer. El diseño del panel y la estrategia de gating son idénticas a la figura 1. Las células tetrámero positivos aparecen como una población CD4 alto nivel de aceptación en el anti-CD4 en comparación con el panel tetrámero y un claro de la población CD25 + en el anti-CD25 en comparación con el panel tetrámero.
Figura 3. Representante de "falsos positivos" resultados de la tinción tetramer. El diseño del panel y la estrategia de gating son idénticas a la figura 1. El anti-CD4 en comparación con el panel se muestra un tetrámero indistinta "montículos" manchas. El anti-CD25 en comparación con tetrámero también muestra un "montículo", manchas, sin una tendencia clara hacia el ser CD25 +.
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Discussion
Comprender el papel de las células CD4 + T en la inmunidad es de fundamental importancia. Sin embargo, CD4 + antígeno específico de células T puede ser difícil de detectar y aislar de manera artesanal. Por el contrario, tetrámeros de MHC de clase II permite la visualización directa de las células CD4 + T con el antígeno específico deseado. Este vídeo demuestra el aislamiento, purificación y amplificación in vitro de células T CD4 + y su posterior visualización utilizando tetrámeros. Tetrámeros Clase II son proteínas fluorescentes conjugados formados por la clase II soluble biotinilado α / β dímeros conjugado en torno a un núcleo fluorescente marcada con estreptavidina (Figura 4). Los tetrámeros utilizados en este video fueron producidos por el laboratorio central Teramer en el Instituto de Investigación Benaroya utilizando cultivos de células de insectos (1). Estos tetrámeros se preparan como 0,5 mg / ml de solución y se puede almacenar a 4 ° C durante 6-18 meses. Tetrámeros nunca debe ser congelada, como de congelación y descongelación tensiones pueden retirar la etiqueta PE lejos del núcleo steptavidin. Clase II reactivos de coloración se puede obtener de varias fuentes (Tabla 1) y se designan como tetrámeros, "ultimers", y multímeros. Cabe señalar que el procedimiento de ensayo tetrámero se describe aquí es distinto de los procedimientos utilizados para la clase I tetrámeros. Clase I tinción tetrámero suele ser óptima a 4 ° C, mientras que la clase II tinción tetrámero generalmente requiere de 37 ° C. Clase tetrámeros que se unen más fuertemente a las células T de la Clase II tetrámeros, debido al efecto más fuerte de cooperación de CD8 frente a CD4. El ensayo tetrámero aquí descrito es eficaz en la visualización de las células T específicas para cualquiera de los antígenos extraños o por cuenta propia, pero la fuerza de interacción es de por sí bajos de antígenos propios. Diversas variantes de la prueba son posibles. Por ejemplo, las células CD4 + T puede ser más fraccionada antes de la estimulación (poblaciones por ejemplo, en la memoria e ingenuo), estimulados mediante un conjunto de proteínas o péptidos piscinas (2), o los diversos tratamientos se pueden añadir a diferentes pozos para medir su influencia en el antígeno respuesta específica. Dado que sólo una parte de cada bien que se necesita para el análisis de tetrámero, las células restantes se tiñeron con tetrámero para la clasificación o reservados para otros fines. La configuración de cada experimento será dictado tanto por las características de la muestra y por la pregunta científica que se les pida. Para propósitos de diseño es fundamental conocer el tipo de HLA del donante de sangre, ya que esto influirá en los epítopos que se usan para la expansión y marcará el tetrámero correspondiente que se debe utilizar. Conocimiento del estado de enfermedad o de vacunación también puede ser crucial para interpretar los resultados. Es importante mantener el cuidado de las células durante la etapa de amplificación, ya que las células enfermas pueden dar resultados muy pobres. Además, los controles de configuración de la máquina adecuada, apertura de puerta y negativos son de vital importancia para obtener resultados de alta calidad citometría de flujo.
Figura 4. Esquema de MHC de clase II tetrámero. El núcleo rojo representa la molécula estreptavidina-PE. Las extensiones de verde y negro representan el MHC de clase II α / β dímeros. El complejo se une a la interacción de alta afinidad entre la biotina y estreptavidina.
Tabla 1: Diversas fuentes de los reactivos de tinción de clase II
| Tetrámero Fuente | Tipo de producto | Dirección web |
| Beckman Coulter | Tetrámeros | www.beckman.com |
| NIH Tetramer Fondo | Tetrámeros | www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core |
| Proimmune | Ultimers | www.proimmune.com |
| Benaroya Research Institute | Multímeros | www.benaroyaresearch.org |
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Acknowledgments
Agradecemos a Dick Foley y Kimball Leigh por su papel clave en la filmación y producción de vídeo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR international | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | Hyclone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond Scientific | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman Coulter Inc. | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR international | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR international | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalge Nunc international | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon BD | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD Biosciences | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
