Summary
We beschrijven de fijne ontleding van het stomatogastric zenuwstelsel uit de maag van de Amerikaanse kreeft (
Abstract
Met het doel om te begrijpen hoe zenuwstelsel activiteit te produceren en te reageren op het milieu, neurowetenschappers wenden tot model systemen die de activiteit van belang vertonen en zijn toegankelijk en vatbaar voor experimentele methoden. Het stomatogastric zenuwstelsel (STNS) van de Amerikaanse kreeft (
Protocol
Voorafgaand aan het begin van dit protocol de maag van de kreeft moet worden verwijderd uit het dier en bereid zoals beschreven in de metgezel Jupiter artikel (Bierman & Tobin, 2009). De meerderheid van de onderstaande maatregelen zijn getroffen om te worden uitgevoerd onder een dissectie microscoop.
Deel I-isoleren van de Commissural Ganglia
- Plaats de schotel, zodat de voorste einde (door de lip) uit de buurt is van jou en het achterste einde (door de pylorus) is naar u toe.
- Zorg ervoor dat de maag is gespeld, zodat het ligt zo plat mogelijk op de schotel.
- Pin de slokdarm aan beide zijden van de lip.
- Indien nodig, de volgorde van de andere pinnen geplaatst tijdens de bruto-dissectie.
- Verwijder de hypodermis.
- Pak de hypodermis de buurt van de gm2/gm3 spieren, verwijdert u deze en deze spieren en trek in de voorste richting.
- Scheid de hypodermis van de onderliggende vet door knippen verbindingen worden gemaakt. Gebruik extra zorg rond de centrale ader, die een belangrijk deel van het stomatogastric zenuwstelsel omsluit. Laat de hypodermis intact binnen ongeveer een 0,5 cm straal van de stomatogastric ganglion, die zit tussen de gm1b spieren.
- Snij gescheiden hypodermis.
- Maak de hersenen van het onderliggende weefsel.
- Identificeer de twee grote commissural zenuwen die bilateraal project van de voorste gedeelte van de hersenen naar de commissural ganglia in het voorste gedeelte van de maag.
- Het verlaten van deze zenuwen intact, til de hersenen met een tang en snijd aan de hersenen scheiden van de rest van het weefsel. Wees voorzichtig als u dit doet, omdat de stomatogastric zenuw is onder de hersenen en moeten worden bewaard intact.
- Scheid de commissural ganglia van de omliggende het weefsel.
- Volg een van de commissural zenuwen naar een van de commissural ganglia.
- Identificeer de ion en zoon - deze zenuwen moet intact blijven. De commissural ganglion zal veel zenuwen uitstralen. Snijd de meesten van hen (behalve de ion en zoon), maar laat een extra zenuw aan de commissural ganglion zijn plaats te houden terwijl u klaar bent met de dissectie.
- Herhaal met de andere commissural ganglion.
- Reinig de ion en zoon van lateraal naar mediaal. Laat de labiale zenuw intact aan het zenuwstelsel anker naar de maag. De slokdarm ganglion zit werden snijden de ion s. Je kan duidelijk daaronder worden gehouden door grijpen de inferieure ventriculaire zenuw en omhoog te trekken naar onder te snijden.
Deel II-isoleren van de Stomatogastric Ganglion (STG) en de resterende zenuwen.
- Scheid de STG uit de omliggende het weefsel.
- De STG zit in een slagader die loopt tussen de gm1b spieren en neer naar de gm2a, b spieren. Kijk voor het afgesneden uiteinde van de ader bij de gm2a, b spieren.
- Trek het afgesneden uiteinde van de slagader omhoog en naar voren, naar de dvn bloot te leggen. Ga verder omhoog te trekken tot aan het niveau van de resterende hypodermis. Eenmaal gescheiden, kan de slagader worden bijgesneden tot het niveau waar het raakt de resterende hypodermis.
- Snijd de spier flap die was gelegen in het rostrum van de kreeft.
- Til de hypodermis boven de slagader, de opmerking dat de slagader een tunnel in het vet boven de STG maakt. Leg een blad van uw schaar in de slagader en snij de spier erboven. Controleer of u kunt de dvn zien als je geknipt om er zeker van bent u veilig boven de STG. Ga verder snijden voren, naar aanleiding van de slagader. Zoals u besnoeiing boven de STG, kunt u zien dat de STN uitgaat naar voren uit de STG en duiken naar beneden in de spier. Blijven snijden voren om de spier volledig te scheiden boven de STG.
- Verwijder eventueel weefsel weg van de STN.
- Scheid de AGN s van het omringende weefsel. (Zelfs als u niet van plan om op te nemen uit de AGN, zal je een deel van de intacte zenuw behoefte vast te pinnen het ganglion voor intracellulaire opnames.)
- Om beter te zien van de AGN s, verwijder het resterende hypodermis en een dun laagje van de onderliggende spier.
- Juist achter de STG, identificeren van een donkere tunnel in het vet en de spieren aan weerszijden van de dvn.
- Stick een schaar in de tunnel en snijd het weefsel boven de zenuw. Ga verder snijden zijdelings, naar aanleiding van de zenuw, om het te isoleren. (Een paar millimeter is voldoende voor pinning het ganglion, maar bloot ten minste 5 mm van de AGN als u van plan op te nemen van.)
- Maak de AGN van de spier innerveert het door het snijden van de verbindingen.
- Herhaal aan de andere kant naar de andere AGN isoleren.
- Zodra beide AGN's zijn ontleed, knip alle spieren en weefsel aansluiten van de STG naar de maag.
- Isoleer de mvn s. Ze zijn een bilaterale paar kleine zenuwen vertakken uit de lvn en doorkruisen lateraal onder het vet.
- Of gebruik schaar of twee pincet om door het vet afgesneden aan de ene kant van de DVN, de buurt waar hij takken in de twee lvn s. Hier bent u ver van de mvn s en zal niet het risico te knippen.
- Til de vetlaag, en identificeren van de kleine mvn eronder. Deze zenuwen lopen mediaal naar lateraal juist achter het niveau van de gm1b spieren.
- Verwijder de laag vet boven de mvn, waardoor de zenuw intact voor nu, zodat het niet zal verward raken. U snijdt de laterale uiteinde van buiten de maag aan het eind van de dissectie.
- Herhaal dit proces aan de andere kant naar de andere mvn isoleren.
- Isoleer de lvn s en achterste zenuwen.
- Te beginnen waar de lvn s tak zijwaarts uit de DVN, een lvn te volgen door het snijden van de vet erboven. Afhankelijk van de voorbereiding, soms de hele dikke laag boven de zenuw kan worden getrokken.
- Ga door het openbaren van de lvn tot het punt waar de PSN vertakt.
- Isoleer de pyn.
- Zoek de pyn, het is een zenuw reist achterzijde over de pylorus.
- Verwijder het dunne membraan dat deze regio.
- Isoleer de pyn door het snijden van een klein deel van de pylorus, verbonden aan de pyn.
- Til de pyloris sectie en weggesneden het weefsel aan weerszijden van de pyn tot u bij de tak die hecht aan de PDN.
- Isoleer de PDN.
- Zoek het PDN, het is een zenuw reist achterzijde van de pyloric dilatator spier.
- Snijd een klein deel van de pyloric dilatator spier, verbonden aan de PDN.
- Til de pyloris dilatator spier gedeelte weggesneden het weefsel aan weerszijden van het PDN tot u bij de tak die hecht aan de pyn.
- Isoleer de ventrale lvn, dat de pyn en PDN wordt aangesloten op de LVN.
- Op het driehoekige tak punt waar de pyn en PDN te sluiten op de ventrale lvn, isoleren elk klein deel van de zenuw die zich vertakt uit de ventrale lvn, zoals de vpln. Deze zal worden gebruikt als een handvat te trekken op het ventrale lvn.
- Lift op het handvat en wegknippen het weefsel aan weerszijden van de ventrale lvn, die werkzaam zijn in de anterieure richting tot aan het punt waar de PSN vertakt.
- Herhaal stap 10 - 13 tot en met de lvn en de achterste zenuwen aan de andere kant te isoleren.
- Maak de stomatogastric zenuwstelsel van de maag.
- Om volledig los van de lvn van de maag, trek aan de PSN en snijd alle weefsels en zenuwen aan de lvn en ventrale lvn, met uitzondering van het PDN en pyn. Herhaal dit proces aan de andere kant.
- Snijd de laterale einde van elke mvn. Til de laterale uiteinde en snij elke vreemde attachments tussen de zenuw en het onderliggende weefsel maag.
- Aan het voorste einde, snijd elke vreemde bijlagen aan de commissural ganglia, en snijd de labiale zenuw aan elke kant.
- Visueel scannen de stomatogastric zenuwstelsel systeem om vervolgens te identificeren en snijd eventuele bijlagen naar de maag weefsel.
- Pak op het voorste einde van beide commissural zenuwen, boven de commissural ganglia, en schil de stomatogastric zenuwstelsel uit de maag en het verplaatsen naar de zijkant van de schotel. Als je dit doet, knip alle resterende bijlagen aan het zenuwstelsel vrij.
- Bereid de kleine Sylgard schotel.
- Grondig te wrijven sommige maag weefsel op het oppervlak van de Sylgard in de kleine schotel. Hierdoor neemt de hydrofobiciteit van de Sylgard, zodat zout gelijkmatig zal verdelen over de schotel.
- Spoel en vul de Sylgard gerecht met gekoelde zoutoplossing.
- Overdracht van het zenuwstelsel naar de klaargemaakte Sylgard schotel grijpen de voorste uiteinden van beide commissural zenuwen, het opheffen van het zenuwstelsel uit de grote schaal, en tot in de kleine schotel.
- Speld de STNS in de kleine schotel met een combinatie van minuten pinnen en dunnere pennen gesneden van wolfraam draad.
- Zorg ervoor dat de voorbereiding is dorsale zijde naar boven door te controleren of de mindere ventriculaire zenuw is weg van de Sylgard wijzen.
- Verwijder de hersenen en speld de commissural zenuwen.
- Trek het zenuwstelsel strak en plat door te trekken van elk van de PSN s posterior en lateraal, en spelden ze naar beneden.
- Verwijder de pyloric dilatator spier van het PDN s, en speld de PDN s.
- Verwijder hetpylorus segment van de pyn s, en speld de pyn s.
- Vastpinnen de resterende geïsoleerde zenuwen, zoals de labiale zenuwen, de mvn s en AGN s.
- Desheath de STG.
- Zorg ervoor dat de STG plat tegen de Sylgard en hield strak door de laterale AGN s, de voorste en de achterste STN dvn.
- Schik de verlichting aan visualisatie van de axonen mogelijk te maken binnen de dvn.
- Met behulp van een kleine pin of fijne tungsten naald, maak een klein ondiep gaatje in schede rond de DVN, juist achter de STG.
- Trek de naald over de dvn, dorsaal van de axonen, een horizontale scheur in de zenuw schede te creëren.
- Pak de klep van zenuwschede posterior aan de STG en trek naar voren om de schede te verwijderen uit de dorsale zijde van de STG.
| Afkortingen: | |
| STNS | Stomatogastric zenuwstelsel |
| STG | Stomatogastric ganglion |
| Cog | Commissural ganglion |
| stn | stomatogastric zenuw |
| mvn | mediale zenuw ventriculaire |
| ion | inferieur oesofageale zenuw |
| zoon | superieure oesofageale zenuw |
| AGN | anterior maag zenuw |
| dvn | dorsale zenuw ventriculaire |
| lvn | laterale ventrikel zenuw |
| PSN | posterior maag zenuw |
| vpln | ventrale posterior laterale zenuw |
| pyn | pyloric zenuw |
| PDN | pyloric dilatator zenuw |
Discussion
De anatomie van kreeft maag en STNS is goed eerder 5,6 beschreven, en variaties van deze dissectie procedure zijn gebruikt in talloze studies. We raden aan bekend te raken met de anatomie van de maag 5-7 en STNS 5,8 voor het begin van dissecties. Een dergelijke bekendheid zal verminderen het risico op accidentele schade aan de zenuwen en weefsel.
Voor een duurzaam behoud van de gezondheid van de voorbereiding, is het essentieel om de voorbereiding te handhaven op een koele temperatuur. Dit is eenvoudig te bereiken door het uitwisselen van de zoute elke 30 minuten met 4 ˚ C zoutoplossing bewaard in een koelkast. Bij onderdompeling in koude zoutoplossing, de geïsoleerde STNS voorbereiding is haalbaar voor vele uren. Opnamen in verwante Homarus gammarus hebben aangetoond een stabiele ritmische activiteit van de STG heel 5 dagen in vitro 9, lijkt robuustheid werd gezien in H. americanus (pers. obs.).
Modulerende input voor de STG van de commissural ganglia nodig is om de lopende motor patronen te behouden. Daarom, om een normale ritmische activiteit van deze ganglia en het ion, de zoon te onderhouden en STN zenuwen moeten intact blijven. De dissectie beschrijven we behouden een aantal motorische zenuwen (met motor neuron axons): de AGN s (met daarin Gastric Mill (GM) axonen), de mvn s (met daarin Laterale Gastric (LG) en Inferior Cardiac (IC) axonen), de pyn s (met pylorus neuron (PY) axonen), de PDN s (met pylorus Dilator (PD) axonen), en de lvn s (met daarin Laterale pylorus (LP), mediale maag (MG), LPG axonen evenals die van GM, PD en PY). Door het ontleden van extra (of andere) zenuwen, kunnen andere motor neuron axonen worden opgenomen. Elke individuele type motor neuron axon kunnen individueel worden geregistreerd door het ontleden en opnemen van de zenuw innerveren de spier waarop die soort van neuron projecten.
Dit preparaat kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van studies gericht op het functioneren van het zenuwstelsel. De activiteit van de neuronen kan worden opgenomen hetzij met behulp van de intracellulaire, scherpe elektrode opnames van somata of axonen, of door het opnemen van elektrische impulsen extracellulair van de zenuwen. Veel ion kanalen in de STG neuronen zijn deels gekloond en mRNA kan gemeten worden vanuit de hand getrokken somata 10,11.
Acknowledgments
We willen graag onze adviseur, dr. Eva Marder erkennen. Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Health beurzen NS17813 tot Eva Marder en NS059255 naar AE T.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Tool | California Fine Wire Company | Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins. | |
| Forceps #5 | Tool | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Tool | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Tool | Fine Science Tools | 15370-52 | These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company. |
| Petri Dish (100x15mm) | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | Fill 2-4mm with Sylgard 182. |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26018-17 | Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone. |
| Super fine forceps #5SF | Tool | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Tungsten Needles | Tool | Fine Science Tools | 10130-05 | Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire. |
| Dissection microscope |
References
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).
- Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
- Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen. J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).
- Bierman, H. S., Tobin, A. E. Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus. J Vis Exp. 27, (2009).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).
- Herrick, F. H.
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion. J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).
- Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture. J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).
- Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals. Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).
- Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).
