أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

Summary

وتستخدم على نطاق واسع GFP الانصهار البروتينات لتصور العضيات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ومع ذلك ، الكشف عن الطفرات التي تؤثر في التشكل من العضيات يتطلب عموما الطفرات الفردية وقتا طويلا. هنا ، علينا أن نظهر وسيلة لدمج عضية في وقت واحد ، في GFP علامات الجينات غير الضرورية في 5000 ما يقرب من الخميرة.

Abstract

الإنتاجية العالية لدراسة أساليب توطين البروتين أو التشكل عضية هو أداة فعالة لدراسة التفاعلات بين البروتينات ويمكن أن تساعد في تحقيق فهم شامل للمسارات الجزيئية. السكيراء في البيرة ، مع تطوير مجموعة الجينات الحذف غير الضرورية ، لا يمكننا على الصعيد العالمي في دراسة مورفولوجية العضيات المختلفة مثل شبكية هيولي باطني (ER) وGFP الميتوكوندريا باستخدام (أو متغير) ، علامات في الجينات خلفيات مختلفة. ومع ذلك ، تتضمن علامات GFP الطافرة في كل واحد هو عملية فردية كثيفة العمالة. هنا ، نحن وصف الإجراء الذي يستخدم عادة في المختبرات لدينا. باستخدام نظام الروبوتية للتعامل مع المصفوفات الخميرة ذات الكثافة السكانية العالية وتقنيات اختيار المخدرات ، يمكننا تقصير كبير في الوقت المطلوب وتحسين استنساخ. باختصار ، نحن نعبر علامة GFP الموسومة الميتوكوندريا (Apc1 - GFP) لمجموعة ذات الكثافة العالية من غير الضرورى 4672 المسوخ حذف الجينات التي تعلق نسخة الروبوتية. من خلال اختيار ضعفاني الإنبات ، تبوغ والمزدوجة الانتخاب ، نستعيد كل من الأليلات. نتيجة لذلك ، كل واحد يحتوي على متحولة فرداني Apc1 - GFP أدرجت في مكان به الجيني. الآن ، يمكننا دراسة مورفولوجية الميتوكوندريا في جميع الخلفية غير الضرورية متحولة. باستخدام هذا النهج الإنتاجية العالية ، ويمكننا بسهولة دراسة ورسم المسارات والجينات المشاركة في الميراث وتشكيل العضيات في وضع الخريطة الوراثية البشرية ككل.

Protocol

المواد والأساليب :

1. سلالات الخميرة :
   • ولدت محطة C - GFP العنونة من Acp1 قبل إعادة التركيب مثلي PCR بوساطة استخدام البلازميد pKT128 (يحتوي على وHIS5 GFP) : Acp1 - GFP (GFP : : صاحب). وتأكدت transformants إيجابية الفحص المجهري متحد البؤر وPCR مستعمرة. وكان على خلفية توتر BY7043 (MAT ألفا can1Δ : STE2pr - lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) من بون مختبر (تونغ وبون ، 2006).
   • حذف المسخ صفيف (DMA) (XXX : KanR) : هو مجموعة من المسوخ الحذف عن 5000 من غير الضروري الجينات. وخرجت جميع هذه الجينات غير الأساسية خارجا على G418. الخلفية سلالة من الصفيف BY4741 (MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). وكان لدينا أصلا من DMA بون المختبر.
2. دمج Acp1 - GFP في DMA :
   
   ويتم تكييف البروتوكول التالي لصنع مجموعة من التحليل وGFP الوراثية الاصطناعية (SGA) والتكنولوجيا (تونغ وبون ، 2006) مع بعض التعديلات. تتم كافة الخطوات تعلق متماثلة باستخدام الدوار سنجر عالية الكثافة arraying نظام الروبوتية. بدلا من ذلك ، قد يتم استخدام دليل تعلق أو السائلة المستندة الروبوت arraying عالية الكثافة.
   
   المختصرات : YPD ، استخراج ، ببتون ، خميرة سكر العنب ؛ SD ، الاصطناعية التسرب ؛ LRK ، Lue / الارجنتين / ليز التسرب وسائل الإعلام ؛ LHRK ، Lue / صاحب / الارجنتين / ليز وسائل الاعلام التسرب
   
   إعداد
   1. زراعة الحشيش في Acp1 - GFP الخلايا سكب 5 مل الثقافة Acp1 - GFP بين عشية وضحاها على لوحة YPD. تسمح لوحة لتجف بشكل كاف في لهب أو مغطى الوجه الدخان البيولوجية.
   2. احتضان لوحة في 30 ˚ C بين عشية وضحاها.
   3. باستخدام الروبوت ، مجموعة Acp1 - GFP سلالة المستعمرات في 1536 في لوحة. في الوقت نفسه ، وإعداد نسخة جديدة من قبل دائرة الشؤون البلدية متماثلة تعلق لوحات YPD G418 +.
   4. احتضان لوحات في 30 ˚ C بين عشية وضحاها.
      
      التزاوج واختيار ضعفاني
      
      
   5. لم سلالة Acp1 - GFP مع DMA التي تعلق نسخة والإفراط في زرع المستعمرات على لوحات YPD.
   6. احتضان لوحات في 30 ˚ C بين عشية وضحاها.
   7. طبق الاصل لوحة المستعمرات على SD -- صاحب G418 + لوحات لتحديد الخلايا مضاعفا (MATA / MATalpha).
   8. احتضان لوحات في 30 ˚ C بين عشية وضحاها.
      
      Sporulationg والإنبات
      
      
   9. طبق الاصل لوحة المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام تبوغ المعززة ، التي تحتوي على مستويات منخفضة من مصادر الكربون والنيتروجين للحث على تشكيل أبواغ الانتصافي.
   10. احتضان لوحات عند 25 ˚ مئوية لمدة لا تقل عن 5 أيام.
   11. تنبت على السلالات التي MATA الانتصافي المستعمرات المتماثلة الطلاء على وسائط LRK واحتضان لوحات في 30 ˚ مئوية لمدة يومين.
   12. وهذه وسائل الإعلام لحث انبات خلايا فرداني من الجراثيم. لأن قراءة متكاملة افتتاح LUE2 الإطار (ORF) في المروج STE2 MATA محددة ، فإن جميع haploids نبتت يكون MATA.
       
       اختيار كل من الأليلات
       
       
   13. فقد بات من الضروري لتحديد كلا من أليل GFP وأليل واحد طافر. لتحقيق هذا الهدف ، هي خلايا متماثلة MATA مطلي على وسائل الاعلام LRK G418 + ، الذي يختار لخلايا فرداني التي تحمل الجينات الحذف (الثلاثون : kanR).
   14. احتضان لوحات في 30 ˚ C بين عشية وضحاها.
   15. وأخيرا ، فإن السلالات MATA الانتصافي هي متماثلة مطلي على G418 LHRK + لتحديد وسائل الاعلام لتحقيق النمو من المسوخ واحد (الثلاثون : kanR) بايواء أيضا Acp1 - GFP (GFP : : صاحب). ويمكن تخزين هذه اللوحات في 4 ˚ مئوية لتصل إلى 3 أشهر.
   
   
   ويتم تكييف البروتوكول التالي لصنع مجموعة من التحليل وGFP الوراثية الاصطناعية (SGA) والتكنولوجيا (تونغ وبون ، 2006) مع بعض التعديلات. تتم كافة الخطوات تعلق متماثلة باستخدام الدوار سنجر عالية الكثافة arraying نظام الروبوتية. بدلا من ذلك ، قد يتم استخدام دليل تعلق أو السائلة المستندة الروبوت arraying عالية الكثافة.
   
   المختصرات : YPD ، استخراج ، ببتون ، خميرة سكر العنب ؛ SD ، الاصطناعية التسرب ؛ LRK ، Lue / الارجنتين / ليز التسرب وسائل الإعلام ؛ LHRK ، Lue / صاحب / الارجنتين / ليز وسائل الاعلام التسرب
   
   إعداد
3. المجهر :
   1. اختيار متحولة المطلوب (ق) ، معربا عن Acp1 GFP مباشرة من اللوحة.
   2. زراعة خلايا في 30 درجة مئوية في YPD أو SD -- وسائل الاعلام لصاحب السجل المرحلة المبكرة.
   3. تصور من قبل باستخدام المجهر مبائر filterset GFP. مثال على النتيجة المتوقعة هي تظهر في الشكل 1.

SGA وسائل الإعلام :

وتستخدم بشكل روتيني وسائل الإعلام النمو (YPD) وسائل الاعلام اختيار (SD) المستخدمة في هذا البروتوكول في مجال البيولوجيا الجزيئية الخميرة. يرجى الرجوع إلى أساليب في الخميرة (Amberg وآخرون ، 2005) للحصول على وصف مفصل.

LRK ، LHRK وسائل الإعلام (على مجموع 400 مل)

من أجل إضافة	مبلغ
قاعدة نيتروجينية الخميرة مع كبريتات الامونيوم	2.7 غرام
حمض أمينيمزيج	0.8 غرام
آغار	8 ز
DH 2 O	360 مل
الأوتوكلاف
20 ٪ سكر العنب	40 مل
باردة إلى 65 ˚ C
100 ملغ / مل canavanine	0.2 مل
100 ملغ / مل thialysine	0.2 مل
مزيج ، صب 50 مل لكل لوحة

LRK ، LHRK G418 + الوسائط (على مجموع 400 مل)

من أجل إضافة	مبلغ
قاعدة نيتروجينية الخميرة دون كبريتات الامونيوم	0.7 غرام
مزيج الحمض الأميني	0.8 غرام
أحادية الصوديوم جلتاميت	0.4
آغار	8 ز
DH 2 O	360 مل
الأوتوكلاف
20 ٪ سكر العنب	40 مل
باردة إلى 65 ˚ C
100 ملغ / مل canavanine	0.2 مل
100 ملغ / مل thialysine	0.2 مل
200 ملغ / مل G418	0.4 مل
مزيج ، صب 50 مل لكل لوحة

المخصب تبوغ وسائل الإعلام (على مجموع 400 مل)

من أجل إضافة	مبلغ
أسيتات البوتاسيوم	4 ز
خلاصة الخميرة	0.4 غرام
سكر العنب	0.2 غرام
مزيج من الأحماض الأمينية تبوغ	0.04 ز
آغار	8 ز
DH 2 O	360 مل
الأوتوكلاف
باردة إلى 65 ˚ C
200 ملغ / مل G418	0.4 مل
مزيج ، صب 50 مل لكل لوحة

Discussion

هذا الأسلوب يمكن أن تساعد بشكل فعال إدراج علامة الميتوكوندريا ، Acp1 - GFP متحولة إلى خلفيات مختلفة. فهو يعتمد على استخدام نظام الروبوتية ، ويمكن اعتمادها بسهولة للاستخدام مع أي نظام الروبوتية. ويمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لإدراج أنواع أخرى من علامات. على سبيل المثال ، لتصور ER ، ونحن نستخدم عادة علامة Erg11 - GFP. في الصور ممثلنا ، متحولة ألف ونوع البرية مع صانع Acp1 - GFP كانت visualiz بقلم مبائر المجهري لدراسة مورفولوجية الميتوكوندريا. وأظهرت متحولة النمط الظاهري الميتوكوندريا تعطلت ، وبالتالي فهو مرشح جيد لاجراء مزيد من التحقيقات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.