Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Summary

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Abstract

High-throughput methoden voor het eiwit lokalisatie of organel morfologie te onderzoeken is een effectief instrument voor het bestuderen van eiwit-interacties en kan helpen om een ​​uitgebreide kennis van de moleculaire pathways. In Saccharomyces cerevisiae, met de ontwikkeling van de niet-essentiële gendeletie array, kunnen we wereldwijd de studie van de morfologie van de verschillende organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER) en de mitochondriën met behulp van GFP (of variant)-merkers in de verschillende genen achtergronden. Echter, waarin GFP markers in elke afzonderlijke mutant is individueel een arbeidsintensief proces. We beschrijven hier een procedure die routinematig gebruikt wordt in ons laboratorium. Door het gebruik van een robotsysteem voor high-density gist arrays en drugs selectie technieken te behandelen, kunnen we aanzienlijk verkorten van de tijd die nodig is en de verbetering van de reproduceerbaarheid. Kortom, steken we een GFP-gelabelde mitochondriale marker (Apc1-GFP) om een ​​hoge dichtheid array van 4672 niet-essentiële genen deletiemutanten door robotachtige replica pinnen. Door middel van diploïde selectie, sporulatie, kiemkracht en dubbele marker selectie, we herstellen beide allelen. Als gevolg daarvan, elk haploïde enkele mutant bevat Apc1-GFP opgenomen in zijn genomische locus. Nu kunnen we de studie van de morfologie van de mitochondria in alle niet-essentiële mutant achtergrond. Met behulp van deze high-throughput benadering, kunnen we gemakkelijk bestuderen en af ​​te bakenen van de paden en genen die betrokken zijn bij de erfenis en de vorming van organellen in een genoom-brede setting.

Protocol

Materialen en methoden:

1. Giststammen:
   • Acp1-GFP (GFP:: Zijn): C-terminale GFP-tagging van Acp1 werd gegenereerd door een PCR-gemedieerde homologe recombinatie met behulp van plasmide pKT128 (bevat GFP en HIS5). Positieve transformanten werden bevestigd door confocale microscopie en kolonie PCR. De stam achtergrond was BY7043 (MAT alpha can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) uit Boone lab (Tong en Boone, 2006).
   • Deletiemutant Array (DMA) (xxx:: KanR): het is een serie van ongeveer 5.000 deletiemutanten van niet-essentiële genen. Al deze niet-essentiële genen waren uitgeschakeld op G418. De spanning achtergrond van de array is BY4741 (MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Onze DMA kwam oorspronkelijk uit Boone lab.
2. Waarin Acp1-GFP in de DMA:
   
   Het volgende protocol voor het maken van een GFP-array is een bewerking van de Synthetic Genetic Analysis (SGA) technologie (Tong en Boone, 2006) met wijzigingen. Alle replica pinning stappen zijn gedaan met behulp van een Singer ROTOR high-density arraying robotsysteem. Als alternatief kan manueel pinning of een vloeistof op basis van high-density arraying robot gebruikt worden.
   
   Acroniemen: YPD, gistextract-pepton-dextrose, SD, synthetische uitval, LRK, Lue / Arg / Lys uitval media; LHRK, Lue / Zijn / Arg / Lys uitval media
   
   Voorbereiding
   1. Groeien een grasveld van Acp1-GFP-cellen door het gieten van een 5 ml 's nachts Acp1-GFP cultuur op een YPD plaat. Laat de plaat voldoende droog zijn door een vlam of in een biologisch zuurkast.
   2. Incubeer de plaat bij 30 ˚ C 's nachts.
   3. Met behulp van een robot, array Acp1-GFP zeef in 1536 kolonies per plaat. Op hetzelfde moment, bereiden een nieuwe kopie van de DMA door replica pinnen aan YPD + G418 platen.
   4. Incubeer de platen bij 30 ˚ C gedurende de nacht.
      
      Paring en diploïde selectie
      
      
   5. Mate van de Acp1-GFP stam met de DMA door replica pinnen en over-leggen van de kolonies op YPD platen.
   6. Incubeer de platen bij 30 ˚ C gedurende de nacht.
   7. Replica-plaat de kolonies op SD - Zijn + G418 platen om diploïde cellen (MATA / MATalpha) te selecteren.
   8. Incubeer de platen bij 30 ˚ C gedurende de nacht.
      
      Sporulationg en kieming
      
      
   9. Replica-plaat van de diploïde kolonies op verbeterde sporulatie media, die verlaagde niveaus van koolstof en stikstof-bronnen om de vorming van meiotische sporen opwekken bevat.
   10. Incubeer de platen bij 25 ˚ C voor een minimum van 5 dagen.
   11. Ontkiemen de Mata meiotische nakomelingen van replica-plating de kolonies op LRK media en incubeer de platen bij 30 ˚ C voor twee dagen.
   12. Deze media zal leiden de kieming van haploïde cellen van sporen. Aangezien een LUE2 opening reading frame (ORF) is geïntegreerd in de Mata-specifieke STE2 promotor, zullen alle ontkiemd de haploiden worden Mata.
       
       Selectie van beide allelen
       
       
   13. Het is nu nodig om zowel de GFP-allel en het ene mutant allel te selecteren. Om dit te bereiken, Mata cellen replica-uitgeplaat op LRK + G418 media, die selecteert voor haploïde cellen die het gen deletie (xxx:: kanR) dragen.
   14. Incubeer de platen bij 30 ˚ C gedurende de nacht.
   15. Tot slot, de Mata meiotische nakomelingen zijn replica-uitgeplaat op LHRK + G418 media te selecteren voor de groei van enkele mutanten (xxx:: kanR) ook herbergen Acp1-GFP (GFP:: Zijn). Deze platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ˚ C voor maximaal 3 maanden.
   
   
   Het volgende protocol voor het maken van een GFP-array is een bewerking van de Synthetic Genetic Analysis (SGA) technologie (Tong en Boone, 2006) met wijzigingen. Alle replica pinning stappen zijn gedaan met behulp van een Singer ROTOR high-density arraying robotsysteem. Als alternatief kan manueel pinning of een vloeistof op basis van high-density arraying robot gebruikt worden.
   
   Acroniemen: YPD, gistextract-pepton-dextrose, SD, synthetische uitval, LRK, Lue / Arg / Lys uitval media; LHRK, Lue / Zijn / Arg / Lys uitval media
   
   Voorbereiding
3. Microscopie:
   1. Kies de gewenste mutant (s) uitdrukken Acp1-GFP rechtstreeks uit plaat.
   2. Grow-cellen bij 30 ° C in YPD of SD - Zijn de media te vroeg log-fase.
   3. Visualiseren door confocale microscopie met het GFP filterset. Een voorbeeld van verwachte resultaat is weergegeven in figuur 1.

SGA media:

De groei van media (YPD) en het selecteren van media (SD) die in dit protocol wordt routinematig gebruikt in gist moleculaire biologie. Verwijzen wij u naar Methods in Yeast (Amberg et al.., 2005) voor gedetailleerde beschrijvingen.

LRK, LHRK media (voor 400 ml totaal)

Toe te voegen om	Aantal
Gist stikstofbase met ammoniumsulfaat	2,7 g
Aminozuurmengen	0,8 g
Agar-agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclaaf
20% Dextrose	40 ml
Afkoelen tot 65 ˚ C
100 mg / ml Canavanine	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
Mix, giet 50 ml per plaat

LRK, LHRK + G418 media (voor 400 ml totaal)

Toe te voegen om	Aantal
Gist stikstofbase zonder ammoniumsulfaat	0,7 g
Aminozuur mix	0,8 g
Mononatriumglutamaat	0.4
Agar-agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclaaf
20% Dextrose	40 ml
Afkoelen tot 65 ˚ C
100 mg / ml Canavanine	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
200 mg / ml G418	0,4 ml
Mix, giet 50 ml per plaat

Verrijkt sporulatie media (voor 400 ml totaal)

Toe te voegen om	Aantal
Kaliumacetaat	4 g
Gistextract	0,4 g
Dextrose	0,2 g
Sporulatie aminozuur mix	0,04 g
Agar-agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclaaf
Afkoelen tot 65 ˚ C
200 mg / ml G418	0,4 ml
Mix, giet 50 ml per plaat

Discussion

Deze methode kan efficiënt te voorzien van een mitochondriale marker, Acp1-GFP in verschillende mutant achtergronden. Zij baseert zich op het gebruik van een robotsysteem, en kan gemakkelijk aangenomen voor gebruik met een robotsysteem. Deze procedure kan ook worden gebruikt voor het opnemen van andere soorten markers. Bijvoorbeeld, om te visualiseren ER, we regelmatig gebruik maken van de marker ERG11-GFP. In onze representatieve beelden, een mutant en een wild-type met de Acp1-GFP maker werden visualiz ed door confocale microscopie aan de mitochondria morfologie studie. De mutant toonde verstoord mitochondriale fenotype, en is daarom een ​​goede kandidaat voor verder onderzoek.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.