Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

Summary

GFP-protéines de fusion sont largement utilisés pour visualiser les organites par microscopie confocale. Cependant, le dépistage de mutations qui affectent la morphologie des organites exige généralement mutagenèse individuelle et prend du temps. Ici, nous démontrons une méthode pour intégrer simultanément organite-GFP marqueurs dans près de 5000 gènes non essentiels dans la levure.

Abstract

À haut débit des méthodes pour examiner la localisation des protéines ou de la morphologie organite est un outil efficace pour étudier les interactions entre protéines et peuvent contribuer à atteindre une compréhension globale des mécanismes moléculaires. Chez Saccharomyces cerevisiae, avec le développement de la matrice non essentiels du gène de suppression, on peut globalement étudier la morphologie des organites différents comme le réticulum endoplasmique (RE) et de la GFP en utilisant les mitochondries (ou une variante)-marqueurs dans les antécédents de gènes différents. Cependant, les marqueurs de la GFP incorporant dans chaque mutant unique est individuellement un processus laborieux. Ici, nous décrivons une procédure qui est couramment utilisée dans notre laboratoire. En utilisant un système robotisé pour manipuler des tableaux de la levure de haute densité et des techniques de sélection des médicaments, nous pouvons raccourcir considérablement le temps requis et d'améliorer la reproductibilité. En bref, nous traversons un marqueur GFP-taggés mitochondrial (APC1-GFP) à un tableau à haute densité de 4672 mutants de délétion du gène non essentiel par la robotique réplique épinglage. Grâce à la sélection diploïdes, la sporulation, la germination et la sélection marqueur duel, nous retrouvons les deux allèles. En conséquence, chaque mutant haploïde unique contient APC1-GFP incorporé à son locus génomiques. Maintenant, nous pouvons étudier la morphologie des mitochondries dans toutes les antécédents non essentiels mutant. Grâce à cette approche haut débit, nous pouvons facilement étudier et délimiter les voies et les gènes impliqués dans l'héritage et la formation d'organites dans un cadre à l'échelle du génome.

Protocol

Matériel et méthodes:

1. Les souches de levures:
   • ACP1-GFP (GFP:: Sa): C-terminale de la GFP-tagging ACP1 a été générée par une PCR médiée par recombinaison homologue en utilisant pKT128 plasmide (contient GFP et His5). Les transformants positifs ont été confirmés par microscopie confocale et PCR sur colonie. Le fond souche a été BY7043 (MAT alpha can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) de Boone laboratoire (Tong et Boone, 2006).
   • Suppression Mutant Array (DMA) (xxx:: KanR): c'est un tableau d'environ 5000 mutants de délétion de non-essentielles gènes. Tous ces gènes non essentiels ont été mis KO sur le G418. Le fond souche de la matrice est BY4741 (MATa his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Notre DMA était originaire de Boone laboratoire.
2. Incorporer ACP1-GFP dans le DMA:
   
   Le protocole suivant pour faire une large GFP est adapté de l'analyse synthétique génétiques (SGA) de la technologie (Tong et Boone, 2006) avec des modifications. Toutes les étapes épinglant répliques sont fait en utilisant un ROTOR Chanteur haute densité rangeant système robotisé. Alternativement, manuel épinglant ou un robot à base de liquide rangeant à haute densité peuvent être utilisés.
   
   Acronymes: YPD, extrait-peptone-levure et dextrose; SD, l'abandon de synthèse; LRK, Lue / Arg / Lys abandon des médias; LHRK, Lue / Son / Arg / Lys abandon des médias
   
   Préparation
   1. Cultivez une pelouse de ACP1-GFP cellules en versant un 5 ml de nuit ACP1-GFP de la culture sur une plaque YPD. Laisser sécher la plaque suffisamment par une flamme ou dans une hotte biologique de fumées.
   2. Incuber la plaque à 30 ˚ C la nuit.
   3. Utiliser un robot, un tableau ACP1-GFP souche dans 1536 colonies par plaque. Dans le même temps, préparer une nouvelle copie du DMA en réplique épinglant au YPD + plaques G418.
   4. Incuber les plaques à 30 ˚ C la nuit.
      
      L'accouplement et la sélection des diploïdes
      
      
   5. Maté la souche ACP1-GFP avec le DMA en épinglant répliques et plus de pose des colonies sur des plaques YPD.
   6. Incuber les plaques à 30 ˚ C la nuit.
   7. Réplique plaque des colonies sur SD - Son + plaques G418 pour sélectionner les cellules diploïdes (MATa / MATalpha).
   8. Incuber les plaques à 30 ˚ C la nuit.
      
      Sporulationg et la germination
      
      
   9. Réplique plaque des colonies sur des supports de sporulation diploïdes améliorés, qui contient des niveaux réduits de sources de carbone et d'azote pour induire la formation de spores méiotiques.
   10. Incuber les plaques à 25 ˚ C pendant un minimum de 5 jours.
   11. Germer les descendances MATa méiotique par réplique-placage des colonies sur LRK médias et incuber les plaques à 30 ˚ C pendant deux jours.
   12. Ce support va induire la germination des cellules haploïdes à partir de spores. Depuis un châssis ouvrant LUE2 lecture (ORF) est intégré au niveau du promoteur MATa spécifiques STE2, tous les haploïdes germé sera Mata.
       
       Sélection de deux allèles
       
       
   13. Il est maintenant nécessaire de sélectionner à la fois l'allèle GFP et l'allèle mutant simple. Pour ce faire, les cellules MATa sont des répliques-plaqué sur LRK média G418 +, qui sélectionne les cellules haploïdes qui portent la délétion du gène (xxx:: kanR).
   14. Incuber les plaques à 30 ˚ C la nuit.
   15. Enfin, les descendances MATa méiotique sont des répliques-plaqué sur LHRK média G418 + pour sélectionner à la croissance des mutants simples (xxx:: kanR) a également héberger ACP1-GFP (GFP:: Sa). Ces plaques peuvent être conservés à 4 ˚ C pour un maximum de 3 mois.
   
   
   Le protocole suivant pour faire une large GFP est adapté de l'analyse synthétique génétiques (SGA) de la technologie (Tong et Boone, 2006) avec des modifications. Toutes les étapes épinglant répliques sont fait en utilisant un ROTOR Chanteur haute densité rangeant système robotisé. Alternativement, manuel épinglant ou un robot à base de liquide rangeant à haute densité peuvent être utilisés.
   
   Acronymes: YPD, extrait-peptone-levure et dextrose; SD, l'abandon de synthèse; LRK, Lue / Arg / Lys abandon des médias; LHRK, Lue / Son / Arg / Lys abandon des médias
   
   Préparation
3. Microscopie:
   1. Choisissez le mutant désiré (s) exprimant ACP1-GFP directement à partir de la plaque.
   2. Cultiver des cellules à 30 ° C dans YPD ou SD - Son médias pour la phase log tôt.
   3. Visualisez par microscopie confocale en utilisant les filterset GFP. Un exemple de résultat attendu est de montrer dans la figure 1.

SGA médias:

Les milieux de croissance (YPD) et les médias en sélectionnant (SD) utilisé dans ce protocole est couramment utilisé en biologie moléculaire de la levure. S'il vous plaît se référer aux méthodes dans la levure (Amberg et al., 2005) pour une description détaillée.

LRK LHRK médias (pour 400 ml au total)

Ajouter dans l'ordre	Montant
Base de levure azoté avec du sulfate d'ammonium	2,7 g
D'acides aminésmélangez	0,8 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
Dextrose à 20%	40 ml
Refroidir à 65 ˚ C
100 mg / ml canavanine	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
Mélangez, versez 50 ml par plaque

LRK LHRK + G418 médias (pour 400 ml au total)

Ajouter dans l'ordre	Montant
Base de levure azotés, sans sulfate d'ammonium	0,7 g
Mélange d'acides aminés	0,8 g
Glutamate monosodique	0.4
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
Dextrose à 20%	40 ml
Refroidir à 65 ˚ C
100 mg / ml canavanine	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
200 mg / ml de G418	0,4 ml
Mélangez, versez 50 ml par plaque

Enrichi sporulation médias (pour 400 ml au total)

Ajouter dans l'ordre	Montant
L'acétate de potassium	4 g
L'extrait de levure	0,4 g
Dextrose	0,2 g
Mélange d'acides aminés sporulation	0,04 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
Refroidir à 65 ˚ C
200 mg / ml de G418	0,4 ml
Mélangez, versez 50 ml par plaque

Discussion

Cette méthode peut aider à intégrer efficacement un marqueur mitochondrial, ACP1-GFP dans différents milieux mutant. Elle s'appuie sur l'utilisation d'un système robotique, et peut facilement adoptées pour une utilisation avec n'importe quel système robotisé. Cette procédure peut également être utilisé pour intégrer d'autres types de marqueurs. Par exemple, pour visualiser les ER, nous avons l'habitude utiliser le marqueur Erg11-GFP. Dans nos images représentant, un mutant et une de type sauvage avec le fabricant ACP1-GFP ont été visualiz ed par microscopie confocale pour étudier la morphologie des mitochondries. Le mutant a montré perturbé phénotype mitochondrial, et est donc un bon candidat pour une enquête plus approfondie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.