变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（尿素页）

Summary

变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离单链DNA或RNA的500个核苷酸的限制。在热变性样品和非结构化的单链结合的尿素凝胶基质内迁移，根据其分子量。

Abstract

尿素页面或变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳采用6-8 M尿素，变性中学的DNA或RNA的结构，是他们根据分子量聚丙烯酰胺凝胶矩阵分离。 2至500个碱基之间的片段，如单核苷酸长度的差异，可以分开使用^此方法1。样品的迁移是依赖于所选择的丙烯酰胺浓度。一个比例更高的聚丙烯酰胺解决了低分子量的碎片。尿素和温度为45-55 ° C进行组合，在凝胶运行允许非结构化的DNA或RNA分子的分离。

在一般情况下，这种方法是必需的单链DNA或RNA片段，合成或标记的寡核苷酸酶裂解反应的产品，如分析或净化。

在这个视频文章中，我们展示了如何准备和运行变性尿素聚丙烯酰胺凝胶。包括技术秘诀，除了原有的协议^1,2。

Protocol

为这一实验过程的完整和详细的文字协议是在分子生物学中的电流的协议。 BioRad公司网站³上可以找到详细的一步一步的组装凝胶三明治和凝胶仪器的指示。

所需设备：
玻璃板（内层和外层）
10厘米的电池：10.1 × 7.3厘米（内板），10.1 × 8.2厘米（外盘），BioRad公司
20厘米的电池：20 x 20厘米（内板），20 × 22.3厘米（外盘），BioRad公司
0.5-1.5毫米凝胶梳子和垫片
凝胶铸造立场
凝胶仪器与盖和电缆
高压电源
加热块或水浴
血清移液器和移液器援助
移液器和枪头
凝胶干燥机或扫描仪

试剂和溶液：
尿素（超纯）
40％的聚丙烯酰胺溶液（29:1）
10 × TBE溶液（三硼酸盐，EDTA缓冲）
去离子水，蒸馏水
TEMED
30％（W / V）过硫酸铵溶液
0.5 × TBE溶液
甲酰胺
EDTA
二甲苯蓝
溴酚蓝
甲醇
乙醇

卷	50毫升			60毫升			10毫升
丙烯酰胺浓度	10％	12.5％	15％	10％	12.5％	15％	10％	12.5％	15％
g尿素	24	24	24	28.8	28.8	28.8	4.8	4.8	4.8
ml 40％的丙烯（29:1）	12.5	15.625	18.75	15	18.75	22.5	2.5	3.125	3.75
UL 30％的APS	166	166	166	199.2	199.2	199.2	33	33	33
UL TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
填补了去离子水，蒸馏水的体积

表1：各种丙烯酰胺浓度和体积的需要解决单链寡核苷酸的试剂和解决方案

凝胶三明治装配和凝胶的制备

1. 根据厂家的说明，组装凝胶和修复凝胶，凝胶注^模腔3。使用0.5-1.5毫米厚的垫片。
2. 根据当前的协议，在分子生物学，准备适当的聚丙烯酰胺溶液或如表1所列。变性丙烯酰胺凝胶对于一个20厘米× 22厘米× 1.5毫米，60毫升的凝胶溶液为10.1 × 8.2厘米× 1毫米凝胶5毫升凝胶溶液就足够了。较大的凝胶使用时所预期的产品/乐队范围内的几个基地，然后一个较长的凝胶将解决的一个单核苷酸的差异条带。如果在超过10个核苷酸不同的预期条带，较小的凝胶将适用于解决的片段。选择适合您的分离要求的百分比聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺浓度较高的解决低分子量的碎片。超纯尿素和混合使用所需的丙烯酰胺量。 TBE缓冲液中加入凝胶混合，得到的终浓度为0.5-1 x TBE，并填补了去离子水，蒸馏水的体积。在微波加热20秒的解决方案，它轻轻地混合。对于较大的凝胶卷重复此步骤，直到溶液的手温暖。
3. 倒入凝胶，立即使用血清吸管和两个玻璃板之间的自动吸管援助。避免引入气泡。插入梳子，让凝胶聚合​​为30-60分钟。

成立的电泳仪和prerun凝胶

1. 卸载从铸造室和装配凝胶仪器以生产指示³凝胶。
2. 填写较低的缓冲室机智运行缓冲液（0.5-1 x，简称TBE），玻璃板将分合并后的2-3厘米缓冲区。填写上层缓冲液槽凝胶顶部运行缓冲。
3. 小心取出梳子和运行缓冲液冲洗加载提示使用吸管和凝胶的井。
4. 将凝胶系统和电缆插头盖到一个高电压电源。你可以载入你的样品之前，你必须prerun至少30分钟凝胶热凝胶和凝胶去除剩余的尿素。最佳温度应介于45-55 ° C。避免温度高于60 ° C的频段可以涂抹或玻璃板可以破解。选择不断为prerun每凝胶（15-25 W）瓦。

样品制备

1. 在此期间，准备你的样品。因此，添加适量的2 ×凝胶装载组合来样。装载组合通常含有90％甲酰胺，0.5％EDTA，0.1％二甲苯蓝，0.1％溴酚蓝。
2. 在采集标本之前，可以装入凝胶，样品必须在70-90 ° C之间通过加热几分钟样品热变性。

加载和运行的凝胶

1. prerun是完成时，取下盖子，并彻底冲洗尿素浸出入井前的口袋。
2. 仔细将样品从底部的口袋。避免引入气泡。载入缓冲区已被应用到囊中羞涩，在运行过程中保持平等的条件。
3. 组装的盖子，并在不断瓦运行的凝胶，凝胶温度保持55 ° C类似的prerun。观察标记的染料迁移，染料前端，直到达到凝胶低端。运行时间是依赖于使用丙烯酰胺的百分比，离子强度的缓冲液和凝胶厚度。运行，可以持续2-4小时之间。
   检查上胶的温度。凝胶温度计可以帮助监测在运行过程中适当的温度。

处理凝胶

1. 当染料前端已达到凝胶凝胶较低的缓冲室。从试验箱中取出凝胶和松开夹具。拉开间隔，并仔细拆解玻璃板。如有必要，切去上部以及含有凝胶的一部分。
2. 小心地转移到一盘菜凝胶，凝胶固定的解决方案（TBE加5-10％的甲醇和乙醇的浓度相同）。凝胶保留到5-10分钟的解决方案，并更改缓冲区两次。
3. 凝胶是准备进一步处理，采用真空凝胶干燥机或直接扫描凝胶。

Discussion

1. 带的清晰度取决于几个因素。夏普带装样量应尽可能小，即理想之间的1-5μL。然而，到15μL可装载仍然确保接受的解决办法。样品量少，更清晰的频段量结果。
2. 该乐队的质量也取决于凝胶的厚度。稀释剂的凝胶，如0.75毫米，大于1.5毫米厚的凝胶显示较好的效果。
3. 乐队的形状也可以在凝胶加载的影响，如果样品是不能进入凝胶的口袋里同样适用。包括10％的装载缓冲甘油有助于在凝胶装载和更容易入井的样品片。
4. 与上样缓冲连接的另一个潜在的问题，可能会发生，如果预期的产品（S）运行在同一水平加载染料之一。此外，如果使用荧光标记，某些染料显示在一个类似的波长的荧光信号。如果这种情况下，删除一个染料或所有染料，可以解决这个问题。然后，它应运行在一个标准大小的空井的染料含样本。
5. 在开始运行时的低电压也有助于得到更清晰的乐队，作为样品进入凝胶前顺利，它避免了由于高电压，凝胶口袋崩溃。一个短期的低百分比丙烯酰胺浓缩胶（4％），可以有相同的带锐化效果。
6. 经常遇到的问题是凝胶“微笑”，这是由于通过凝胶电泳过程中热分布不均匀。如果凝胶不被缓冲包围，取决于系统采用凝胶，附加一个金属板，玻璃板支持平等的热分布，可以大大增加凝胶的质量。
7. 较大的凝胶玻璃板Silanizing建议，因为它大大提高了运行后的凝胶处理，如凝胶倾向于坚持玻璃板。

变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（尿素PAGE）是有用的分析或单独的单链DNA或RNA片段，以及radionucleotide或荧光标记的样品。