Denaturing polyacrylamide דשן ג'ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Summary

Denaturing polyacrylamide אוריאה ג'ל אלקטרופורזה משמשת נפרד חד גדילי דנ"א או רנ"א עד לגבול של 500 נוקלאוטידים. אוראה בשילוב עם denatures דגימות חום גדילי יחיד מובנה נודדים בתוך המטריצה ​​ג'ל לפי משקל מולקולרי שלהם.

Abstract

PAGE דשן או denaturing polyacrylamide אוריאה ג'ל אלקטרופורזה מעסיקה 6-8 אוריאה M, אשר denatures DNA משני מבנים או RNA, והוא משמש להפרדה שלהם במטריצה ​​polyacrylamide ג'ל על בסיס משקל מולקולרי. שברים בין 2-500 בסיסים, עם הבדלי אורך קטנים כמו נוקלאוטיד יחיד, ניתן להפריד בשיטה ^{זו: 1.} ההגירה של המדגם תלוי בריכוז acrylamide הנבחר. אחוז גבוה יותר של polyacrylamide פותר שברי משקל מולקולרי נמוך. השילוב של אוריאה וטמפרטורות של 45-55 מעלות צלזיוס בזמן הריצה ג'ל מאפשר להפריד את ה-DNA לא מובנים או מולקולות RNA.

באופן כללי שיטה זו נדרש לנתח או לטהר גדילי דנ"א בודדות או קטעי RNA, כמו oligonucleotides או מוצרים מסונתז או תווית של תגובות אנזימטיות מחשוף.

במאמר זה אנו מציגים וידאו כיצד להכין ולהפעיל polyacrylamide ג'לים denaturing אוריאה. טיפים טכניים כלולים, בנוסף ^1,2 הפרוטוקול המקורי.

Protocol

פרוטוקול טקסט מלא ומפורט עבור הליך זה ניסיוני זמין הפרוטוקולים נוכחי בביולוגיה מולקולרית. מפורט צעד אחר צעד הוראות הרכבה של הכריך ג'ל ועל מנגנון ג'ל ניתן למצוא באתר האינטרנט של BioRad ^3.

ציוד חובה:
צלחות זכוכית (פנימית וחיצונית)
תא 10 ס"מ: 10.1 x 7.3 ס"מ (צלחת הפנימי), 10.1 x 8.2 ס"מ (צלחת החיצוני), BioRad
תא 20 ס"מ: 20 x 20 ס"מ (צלחת פנימי), 20 x 22.3 ס"מ (צלחת החיצוני), BioRad
0.5-1.5 ג'ל מסרק מ"מ מפרידי
ג'ל לעמוד הליהוק
ג'ל מנגנון עם מכסה וכבלים
כבלי מתח האספקה
חימום לחסום או מי האמבט
Pipettes סרולוגית וסיוע פיפטה
פיפטה ו פיפטה טיפים
הג'ל מייבש או סורק

ריאגנטים פתרונות:
דשן (ultrapure)
Polyacrylamide פתרון 40% (29:1)
10 x TBE פתרון (טריס-borate, EDTA חיץ)
Deionized, מים מזוקקים
TEMED
30% (w / v) persulfate פתרון אמוניום
0.5 x פתרון TBE
לפוראמיד
EDTA
קסילן cyanol
Bromphenol כחול
מתנול
אתנול

נפח	50 מ"ל			60 מ"ל			10 מ"ל
Acrylamide ריכוז	10%	12.5%	15%	10%	12.5%	15%	10%	12.5%	15%
גרם אוריאה	24	24	24	28.8	28.8	28.8	4.8	4.8	4.8
אקריל מ"ל 40% (29:1)	12.5	15.625	18.75	15	18.75	22.5	2.5	3.125	3.75
ul 30% APS	166	166	166	199.2	199.2	199.2	33	33	33
ul TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
מלאו את עוצמת הקול עם מים מזוקקים deionized

טבלה 1: ריאגנטים והפתרונות הדרושים ריכוזי acrylamide ואמצעי אחסון שונים לפתרון oligonucleotides תקועים אחד

כריך ג'ל הרכבה ג'ל הכנה

1. להרכיב את הג'ל על פי התיאור יצרנים לתקן את ג'ל הג'ל הליהוק קאמרית ^3. השתמש 0.5-1.5 מפרידי עבה מ"מ.
2. הכן את הפתרון המתאים polyacrylamide פי פרוטוקולים הנוכחי בביולוגיה מולקולרית או כמפורט בטבלה 1. עבור ג'ל acrylamide denaturing של 20 ס"מ X 22 ס"מ X 1.5 מ"מ, 60 מ"ל של תמיסת ג'ל ובמשך 10.1 x 8.2 ס"מ x 1 מ"מ ג'ל 5 מ"ל ג'ל פתרון מספיק. ג'ל מוגדלת משמשים כאשר המוצרים צפוי / להקות נמצאים בטווח של כמה בסיסים, אז ג'ל כבר יפתור להקות עם הבדל של נוקלאוטיד בודד. אם להקות צפוי שונים יותר מ -10 נוקלאוטידים, ג'לים קטן יהיה מתאים כדי לפתור את שברי. בחר את אחוז polyacrylamide שמתאים לדרישות ההפרדה שלך, ריכוזים גבוהים polyacrylamide יפתור שברי משקל מולקולרי נמוך. השתמש אוריאה ultrapure ומערבבים עם הסכום הרצוי acrylamide. הוסף חוצץ TBE לערבב את הג'ל לקבל ריכוז סופי של 0.5-1 x TBE ולמלא את עוצמת הקול עם מים, deionized מזוקקים. מחממים את הפתרון למשך 20 שניות במיקרוגל ומערבבים בעדינות. עבור אמצעי אחסון ג'ל גדול לחזור על שלב זה עד הפתרון הוא חם ביד.
3. יוצקים את הג'ל באופן מיידי באמצעות פיפטה סרולוגיות וכן סיוע פיפטה אוטומטית בין שני לוחות זכוכית. הימנע החדרת בועות אוויר. הכנס את המסרק ולתת הג'ל לפלמר במשך 30-60 דקות.

הגדרת מנגנון אלקטרופורזה ו prerun את הג'ל

1. לרדת את הג'ל מהאולם הליהוק והרכבה אותו מנגנון ג'ל לפי ההוראות מייצרת ^3.
2. החדר מלא שנינות נמוך חיץ חיץ ריצה (0.5-1 x TBE) כי לוחות הזכוכית יהיה תתהתמזגה 2-3 ס"מ עם חיץ. מלאו את תא חיץ העליון עד החלק העליון של הג'ל עם ריצה חיץ.
3. הסר בזהירות את המסרק ולשטוף את הבארות עם חיץ פועל באמצעות פיפטה וג'ל טעינת עצות.
4. צרף את המכסה של מערכת ג'ל וחבר בכבלים כדי לספק מתח גבוה חשמל. לפני שתוכל לטעון דגימות שלך אתה צריך prerun את הג'ל על לפחות 30 דקות כדי לחמם את הג'ל מעלה כדי להסיר אוריאה שנותרה מן הג'ל. הטמפרטורה האופטימלית צריכה להיות בין 45-55 ° C. הימנע טמפרטורות גבוהות יותר מאשר 60 ° C כמו להקות למרוח או לוחות הזכוכית יכול יכול לפצח. בחר וואט קבוע עבור prerun (15-25 וואט לכל ג'ל).

לדוגמא הכנה

1. בינתיים להכין דגימות שלך. לכן, הוסף את הכמות המתאימה של 2 x לערבב ג'ל טעינת המדגם שלך. תמהיל טעינת לפוראמיד מכיל בדרך כלל 90%, 0.5% EDTA, cyanol קסילן 0.1% וכחול bromphenol 0.1%.
2. לפני דגימות ניתן לטעון על הג'ל, דגימות חייב להיות חום מפוגל ידי חימום הדגימות בין 70-90 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות.

לטעון ולהפעיל את הג'ל

1. כאשר prerun נגמר, להסיר את המכסה ולשטוף ביסודיות את כיסי כפי שתואר קודם כמו אוריאה חילחלה בארות.
2. החל את דגימות בזהירות מהחלק התחתון של הכיס. הימנע החדרת בועות אוויר. טוען חיץ צריך להיות מיושם כיסים ריקים כדי לשמור על תנאים שווים במהלך הריצה.
3. להרכיב את המכסה ולהפעיל את הג'ל על וואט קבוע כדי לשמור על טמפרטורה של 55 ° ג'ל דומה prerun ה-C. שימו לב ההגירה של צבעים סמן עד הכניסה לצבוע הגיע לסוף התחתון של הג'ל. משך לרוץ תלוי באחוז acrylamide בשימוש, חוזק היוני של למאגר ועובי ג'ל. ריצה יכולה להימשך בין 2-4 שעות.
   בדיקת טמפרטורה של הג'ל. מדחום ג'ל יכול לעזור לפקח על הטמפרטורה הנכונה בזמן הריצה.

תהליך ג'ל

1. כאשר החזית לצבוע הגיע לסוף של הג'ל לשים את הג'ל מתוך החדר חיץ נמוך. הסר את ג'ל מבית הבליעה וגם לשחרר את המלחציים. משוך ממנו את מפרידי ובזהירות להסוות לוחות הזכוכית. אם יש צורך לחתוך העליון המכיל גם חלק ג'ל.
2. בזהירות להעביר את הג'ל לתוך צלחת עם פתרון ג'ל קיבעון (ריכוז זהה של TBE בתוספת מתנול% אתנול ו 5-10). השאירו את הג'ל לתוך התמיסה למשך 5-10 דקות ולשנות את חיץ פעמיים.
3. הג'ל הוא מוכן להמשך עיבוד באמצעות ג'ל ואקום מייבש או סריקה ישירה של הג'ל.

Discussion

1. החדות הלהקה תלוי במספר גורמים. היקף המדגם טעון ללהקות חדה צריך להיות קטן ככל האפשר, כלומר באופן אידיאלי בין μl 1-5. עם זאת, עד 15 μl ניתן לטעון שעדיין מבטיח פתרון מקובל. פחות נפח דגימה תוצאות להקות חדות.
2. איכות הלהקה תלוי גם בעובי ג'ל. ג'ל רזה יותר, כגון 0.75 מ"מ להראות תוצאות טובות יותר מאשר 1.5 ג'ל סמיך מ"מ.
3. הצורה של להקות יכולים גם להיות מושפעים במהלך טעינת ג'ל, אם המדגם אינו חל במידה שווה לכיס ג'ל. כולל גליצרול 10% למאגר טוען עוזר במהלך טעינת ג'ל ואת כיורים מדגם לבאר בקלות רבה יותר.
4. בעיה נוספת פוטנציאל זה קשור למאגר טעינת מדגם יכול להתרחש, אם המוצר צפוי (ים) הפועלת ברמה זהה לזו של צבעים הטעינה. בנוסף, אם תוויות ניאון משמשים, צבעים מסוימים להראות אות ניאון באורך גל דומה. אם זה המקרה הסיר את אחד צבע או כל צבעי יכול לפתור את הבעיה. לאחר מכן מומלץ להפעיל את המדגם צבען המכילים היטב ריקה כסטנדרט גודל.
5. מתח נמוך בתחילת הריצה מסייעת גם להגיע להקות חדות, כמו המדגם נכנס בצורה חלקה הקדמי ג'ל כי זה ימנע כיסי ג'ל התמוטטות עקב מתח גבוה. Acrylamide קצר אחוז נמוך לערום ג'ל (4%) יכול לקבל את אותו אפקט הלהקה חידוד.
6. לעיתים קרובות נתקל בבעיה הוא ג'ל "מחייך", אשר בשל חלוקת חום אחידה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה במהלך. אם הג'ל אינו מוקף חיץ, תלוי באיזו מערכת ג'ל הוא מועסק, צירוף של צלחת מתכת לצלחת זכוכית תומך חלוקת חום שווה והוא יכול להגדיל באופן משמעותי את איכות ג'ל.
7. Silanizing של צלחות זכוכית ג'לים יותר מומלץ, שכן הוא משפר באופן משמעותי את הטיפול ג'ל אחרי ריצה, כמו ג'ל נוטים לדבוק לוחות הזכוכית.

Denaturing polyacrylamide אוריאה ג'ל אלקטרופורזה (דשן-PAGE) כדאי לנתח או נפרדים גדילי דנ"א יחיד או קטעי RNA, כמו גם דגימות radionucleotide או ניאון שכותרתו.