Poliacrilamida electroforesis en gel de urea (urea PÁGINA)

Summary

Poliacrilamida electroforesis en gel de urea se utiliza para separar una sola cadena de ADN o ARN, hasta un límite de 500 nucleótidos. Urea en combinación con el calor desnaturaliza las muestras y no estructurados cadenas simples migrar dentro de la matriz de gel de acuerdo a su peso molecular.

Abstract

PÁGINA urea o desnaturalización de poliacrilamida electroforesis en gel de urea cuenta con 8.6 M de urea, lo que desnaturaliza el ADN o ARN estructuras secundarias y se utiliza para su separación en una matriz de gel de poliacrilamida en base al peso molecular. Fragmentos de entre 2 y 500 bases, con las diferencias de longitud tan pequeño como un solo nucleótido, pueden ser separados utilizando este método ^1. La migración de la muestra depende de la concentración de acrilamida elegido. Un mayor porcentaje de poliacrilamida se resuelve fragmentos de menor peso molecular. La combinación de urea y temperaturas de 45-55 ° C durante la ejecución del gel permite la separación de ADN no estructurados o moléculas de ARN.

En general, este método es necesario para analizar o purificar el ADN de cadena sencilla o fragmentos de ARN, tales como los oligonucleótidos sintetizados o etiqueta o de los productos de las reacciones de escisión enzimática.

En este artículo de vídeo que muestran cómo preparar y ejecutar los geles de poliacrilamida desnaturalizantes urea. Consejos técnicos se incluyen, además de los ^1,2 del protocolo original.

Protocol

El protocolo de texto completo y detallado de este procedimiento experimental está disponible en los protocolos actuales en biología molecular. Detalladas paso a paso las instrucciones para el montaje del bocadillo de gel y gel para los aparatos se pueden encontrar en el sitio web BioRad ^3.

Equipo necesario:
Placas de vidrio (interior y exterior)
10 cm de células: 10,1 x 7,3 cm (placa interior), 10,1 x 8,2 cm (la placa exterior), BioRad
20 cm de células: 20 x 20 cm (placa interior), 20 x 22,3 cm (placa exterior), BioRad
0.5-1.5 mm peine de gel y espaciadores
Gel de pie de fundición
Gel aparato con tapa y cables
Suministro de alta tensión
El bloque de calentamiento o baño de agua
Pipetas serológicas y la ayuda de pipetas
Pipeta y puntas de pipeta
Gel secador o un escáner

Reactivos y soluciones:
Urea (ultrapura)
40% de poliacrilamida solución (29:1)
10 x TBE solución (Tris-Borato, EDTA)
Agua desionizada, destilada
TEMED
30% (w / v) de persulfato de amonio
0,5 x TBE solución
Formamida
EDTA
Cyanol xileno
Azul de bromofenol
Metanol
Etanol

Volumen	50 ml			60 ml			10 ml
Acrilamida concentración	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%
g de urea	24	24	24	28.8	28.8	28.8	4.8	4.8	4.8
ml 40% acrílico (29:1)	12.5	15.625	18.75	15	18.75	22.5	2.5	3.125	3.75
UL 30% de APS	166	166	166	199.2	199.2	199.2	33	33	33
ul TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
Llenar el volumen con agua desionizada, destilada

Tabla 1: Reactivos y soluciones necesarias para los diferentes concentraciones de acrilamida y los volúmenes para la resolución de un solo varados oligonucleótidos

Gel de montaje sandwich y gel de preparación

1. Montar el gel de acuerdo a la descripción de los fabricantes y fijar el gel en la cámara de gel-casting ^3. Utilice separadores de 0.5-1.5 mm de espesor.
2. Prepare la solución de poliacrilamida apropiada de acuerdo con los protocolos actuales en biología molecular o como se indica en la Tabla 1. Para un gel de acrilamida desnaturalizante de 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml de solución de gel y un 10,1 x 8,2 cm x 1 mm de gel de solución al 5 ml de gel es suficiente. Mayor geles se utilizan cuando los productos esperados / las bandas están dentro del rango de unas pocas bases, a continuación, un gel ya se resolverán las bandas con una diferencia de un solo nucleótido. Si las bandas se espera difieren en más de 10 nucleótidos, más pequeños geles se permite la resolución de los fragmentos. Elegir el porcentaje de poliacrilamida que se adapte a sus necesidades de separación, una mayor concentración de poliacrilamida resolverá menor fragmentos de peso molecular. El uso de urea ultrapura y se mezclan con la cantidad deseada de la acrilamida. Añadir tampón TBE a la mezcla de gel para conseguir una concentración final de 0,5 a 1 x TBE y llenar el volumen con agua desionizada, destilada. Se calienta la solución durante 20 segundos en el microondas y mezclar suavemente. Para grandes volúmenes de gel repetir este paso hasta que la solución es la mano caliente.
3. Verter el gel inmediatamente con una pipeta serológica y una pipeta automática de la ayuda entre las dos placas de vidrio. Evitar la introducción de burbujas de aire. Inserte el peine y dejar polimerizar el gel durante 30-60 minutos.

La instalación del equipo de electroforesis y el gel prerun

1. Desmontar el gel de la cámara de fundición y montaje para el aparato de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante ^3.
2. Llenar la cámara baja del buffer ingenio en funcionamiento (0,5-1 x TBE) que las placas de vidrio se subse fusionó con 2-3 cm de amortiguamiento. Llenar la cámara de amortiguación superior hasta la parte superior del gel con el funcionamiento de amortiguación.
3. Retire con cuidado el peine y lave los pocillos con tampón en ejecución mediante una pipeta y puntas de carga de gel.
4. Fijar la tapa del sistema de gel y conectar los cables a una fuente de alimentación de alta tensión. Antes de poder cargar las muestras que tiene que prerun el gel por lo menos 30 minutos para calentar el gel y para eliminar la urea restante del gel. La temperatura óptima debe estar entre 45-55 ° C. Evite las temperaturas superiores a 60 ° C en forma de bandas podría manchar o las placas de vidrio se puede romper. Elija vatios constante para el prerun (15-25 W por gel).

Preparación de la muestra

1. Mientras tanto preparar las muestras. Por lo tanto, añadir la cantidad apropiada de la mezcla de carga 2 x gel de la muestra. La mezcla de carga por lo general contiene 90% formamida, EDTA 0,5%, 0,1% cyanol xileno y 0,1% azul de bromofenol.
2. Antes de que las muestras pueden ser cargados en el gel, las muestras deben ser el calor desnaturalizado por calentamiento de las muestras entre los 70-90 º C durante unos minutos.

Cargar y ejecutar el gel

1. Cuando el prerun haya terminado, retire la tapa y enjuagar los bolsillos bien como se describió anteriormente como la urea ha infiltrado en los pozos.
2. Aplicar las muestras cuidadosamente desde el fondo de la bolsa. Evitar la introducción de burbujas de aire. Tampón de carga se debe aplicar a los bolsillos vacíos para mantener la igualdad de condiciones durante la carrera.
3. Montar la tapa y ejecutar el gel en vatios constante para mantener una temperatura de gelificación de 55 ° C similar a la prerun. Observar la migración de los colorantes marcador hasta que el frente tinte alcanzado el extremo inferior del gel. La duración de ejecución depende del porcentaje de acrilamida usada, la fuerza iónica del buffer y grosor del gel. Una carrera puede durar entre 2-4 horas.
   Comprobar la temperatura del gel. Un termómetro de gel pueden ayudar a controlar la temperatura adecuada durante la carrera.

Proceso del gel

1. Cuando el frente de tinte ha llegado al final del gel se pone el gel de la cámara de amortiguación inferior. Quitar el gel de la cámara y aflojar las abrazaderas. Extraiga los separadores y cuidadosamente disimular las placas de vidrio. Si es necesario cortar la parte superior y que contiene parte del gel.
2. Transferir cuidadosamente el gel en un plato con una solución de gel de fijación (la misma concentración de TBE más metanol y el etanol 10.5%). Deje que el gel en la solución durante 5-10 minutos y cambiar el búfer dos veces.
3. El gel está listo para su posterior procesamiento con un secador de gel de vacío o de exploración directa del gel.

Discussion

1. La nitidez de la banda depende de varios factores. El volumen de muestra cargada de bandas de fuerte debe ser lo más pequeña posible, es decir, lo ideal es entre 1.5 l. Sin embargo, hasta 15 l puede ser cargado que todavía asegura una resolución aceptable. Menos de resultados de la muestra de volumen en las bandas más nítida.
2. La calidad de la banda también depende del grosor del gel. Diluyente geles, como por ejemplo 0,75 mm muestran mejores resultados que los geles 1,5 mm de espesor.
3. La forma de las bandas también pueden influir en la carga del gel, si la muestra no se aplica por igual en la bolsa de gel. Incluyendo 10% de glicerol en el tampón de carga ayuda durante la carga del gel y se hunde en el pozo de la muestra con mayor facilidad.
4. Otro problema potencial que está conectado con el tampón de carga de la muestra puede ocurrir, si el producto esperado (s) se ejecuta en el mismo nivel como uno de los tintes de carga. Además, si se utilizan marcadores fluorescentes, los tintes de mostrar una señal fluorescente a una longitud de onda similar. Si este es el caso de la eliminación de un colorante o tintes todos podemos solucionar este problema. A continuación, se recomienda ejecutar el ejemplo de medio de contraste que contienen en un pozo vacío en un tamaño estándar.
5. De baja tensión en el comienzo de la carrera también ayuda a conseguir más nítidas bandas, como la muestra entra en la parte delantera de gel suave y evita que el colapso de gel bolsillos debido a la alta tensión. Un bajo porcentaje de acrilamida corto gel de apilamiento (4%) pueden tener la misma banda de afilado efecto.
6. Un problema frecuentemente encontrado es el gel "sonriente", que se debe a la desigual distribución del calor a través del gel durante la electroforesis. Si el gel no está rodeado de amortiguamiento, según la cual el sistema se emplea gel, adjuntando una placa metálica de la placa de cristal compatible con una distribución de calor uniforme y puede aumentar sustancialmente la calidad del gel.
7. Silanización de placas de vidrio para grandes geles se recomienda, ya que mejora en gran medida el manejo de los geles después de la carrera, como geles tienden a adherirse a las placas de vidrio.

Poliacrilamida electroforesis en gel de urea (urea-PAGE) es útil para analizar por separado o una sola cadena de ADN, o fragmentos de ARN, así como muestras de radionucleótidos o fluorescentes etiquetados.