Denaturazione Urea elettroforesi su gel poliacrilammide (PAG Urea)

Summary

Denaturazione poliacrilammide gel elettroforesi urea viene utilizzato per separare singolo filamento di DNA o RNA fino ad un limite di 500 nucleotidi. Urea in combinazione con i campioni di calore denatura e non strutturati singoli filamenti migrano all'interno della matrice gel in base al loro peso molecolare.

Abstract

PAGINA urea o denaturazione poliacrilammide gel elettroforesi urea impiega 6-8 M urea, che denatura il DNA o le strutture secondarie dell'RNA e viene utilizzato per la loro separazione in una matrice di gel di poliacrilammide in base al peso molecolare. Frammenti da 2 a 500 basi, con differenze di lunghezza piccolo come un singolo nucleotide, possono essere separati con questo metodo ^1. La migrazione del campione dipende dalla concentrazione di acrilamide scelto. Una percentuale più alta di poliacrilammide risolve frammenti di peso molecolare inferiore. La combinazione di urea e temperature di 45-55 ° C durante la corsa del gel consente la separazione del DNA non strutturati o di molecole di RNA.

In generale, questo metodo è necessario per analizzare o purificare DNA a singolo filamento o di frammenti di RNA, come oligonucleotidi sintetizzati o etichettati o prodotti da reazioni enzimatiche scissione.

In questo articolo mostriamo il video come preparare ed eseguire il gel di poliacrilammide denaturante di urea. Consigli tecnici sono inclusi, oltre ai ^1,2 protocollo originale.

Protocol

Il protocollo testo completo e dettagliato per questa procedura sperimentale è disponibile nei protocolli di corrente in Biologia Molecolare. Dettagliate passo-passo le istruzioni per il montaggio del panino gel e gel per apparecchi possono essere trovati sul sito web BioRad ^3.

Attrezzatura richiesta:
Lastre di vetro (interno ed esterno)
10 celle cm: 10,1 x 7,3 cm (disco interno), 10,1 x 8,2 cm (piastra esterna), BioRad
20 celle cm: 20 x 20 cm (lastra interna), 20 x 22,3 centimetri (piastra esterna), BioRad
0,5-1,5 pettine gel mm e distanziali
Gel fusione stare
Apparato gel con coperchio e cavi
Alimentatore ad alta tensione
Riscaldamento blocco o bagnomaria
Pipette sierologiche e aiuto pipetta
Pipette e puntali
Gel essiccatore o uno scanner

Reagenti e soluzioni:
Urea (ultrapuro)
Poliacrilammide soluzione al 40% (29:1)
10 x soluzione di TBE (Tris-borato, EDTA buffer)
Deionizzata, acqua distillata
TEMED
30% (w / v) di soluzione di persolfato di ammonio
0,5 x TBE soluzione
Formammide
EDTA
Cyanol Xilene
Blu di bromofenolo
Metanolo
Etanolo

Volume	50 ml			60 ml			10 ml
Concentrazione di acrilamide	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%	10%	12,5%	15%
g UREA	24	24	24	28,8	28,8	28,8	4,8	4,8	4,8
ml 40% Acryl (29:1)	12,5	15,625	18,75	15	18,75	22,5	2,5	3,125	3,75
ul APS 30%	166	166	166	199,2	199,2	199,2	33	33	33
ul TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
Riempire il volume con acqua deionizzata, acqua distillata

Tabella 1: Reagenti e soluzioni necessarie per le concentrazioni di acrilamide e vari volumi per la risoluzione di oligonucleotidi singolo filamento

Gel di assemblaggio sandwich e gel di preparazione

1. Montare il gel secondo la descrizione di produttori e fissare il gel in gel-casting da camera ^3. Utilizzare distanziatori 0,5-1,5 mm di spessore.
2. Preparare la soluzione appropriata poliacrilamide in base alle attuali protocolli di biologia molecolare o come indicato nella Tabella 1. Per un gel di acrilammide denaturante di 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml di soluzione di gel e per un 10,1 x 8,2 centimetri x 1 mm gel 5 ml di soluzione di gel è sufficiente. Grandi gel sono usati quando i prodotti attesi / bande sono all'interno della gamma di alcune basi, poi un gel più risolverà bande con una differenza di un singolo nucleotide. Se le bande atteso differiscono in più di 10 nucleotidi, piccoli gel sarà adatto a risolvere i frammenti. Scegli la percentuale di poliacrilammide che si adatta alle vostre esigenze di separazione, una più alta concentrazione di poliacrilamide risolverà inferiore frammenti di peso molecolare. Usa urea ultrapura e mescolare con la quantità desiderata di acrilamide. Aggiungi tampone TBE alla miscela di gel per ottenere una concentrazione finale di 0,5-1 x TBE e riempire il volume con acqua deionizzata, acqua distillata. Riscaldare la soluzione per 20 secondi nel microonde e mescolare delicatamente. Per i volumi gel più ripetere questo passaggio fino a quando la soluzione è la mano calda.
3. Versare il gel immediatamente con una pipetta sierologica e un aiuto pipetta automatica tra le due lastre di vetro. Evitare di introdurre bolle d'aria. Inserire il pettine e lasciare polimerizzare il gel per 30-60 minuti.

Sistemare il dispositivo di elettroforesi e prerun il gel

1. Smontare il gel dalla camera di fusione e di montaggio per l'apparato gel in base alle istruzioni produce ^3.
2. Riempire la camera bassa del buffer buffer di ingegno in esecuzione (0.5-1 x TBE) che le lastre di vetro saranno subfuse 2-3 cm con tampone. Riempire la camera alta del buffer fino alla parte superiore del gel con la gestione del buffer.
3. Rimuovere con attenzione il pettine e lavare i pozzetti con tampone di corsa, utilizzando una pipetta e gel punte di carico.
4. Fissare il coperchio del sistema gel e collegare i cavi ad una alimentazione ad alta tensione. Prima di poter caricare i campioni è necessario prerun il gel per almeno 30 minuti per scaldare il gel e per rimuovere l'urea rimanenti dal gel. La temperatura ottimale dovrebbe essere tra 45-55 ° C. Evitare temperature superiori a 60 ° C come bande potrebbe striscio o le lastre di vetro potrebbe rompersi. Scegli watt costante per il prerun (15-25 W per gel).

Preparazione del campione

1. Nel frattempo preparare i campioni. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 2 mix di caricamento del gel x per il campione. Il mix di caricamento di solito contiene il 90% formammide, 0,5% EDTA, cyanol 0,1% xilene e 0,1% blu di bromofenolo.
2. Prima che i campioni possono essere caricati sul gel, i campioni devono essere denaturato calore riscaldando i campioni tra i 70-90 ° C per qualche minuto.

Caricare ed eseguire il gel

1. Quando il prerun è terminata, togliere il coperchio e lavare accuratamente le tasche, come descritto prima che l'urea ha colato nei pozzetti.
2. Applicare i campioni con attenzione dal fondo della tasca. Evitare di introdurre bolle d'aria. Caricamento del buffer deve essere applicata a tasche vuote per mantenere la parità di condizioni durante la corsa.
3. Montare il coperchio ed eseguire il gel a watt costante per mantenere una temperatura gel di 55 ° C simile al prerun. Osservare la migrazione dei coloranti marcatore fino a quando il fronte del colorante raggiunge l'estremità inferiore del gel. La durata di esecuzione dipende dalla percentuale di acrilammide utilizzati, forza ionica del tampone e lo spessore del gel. Una corsa può durare da 2-4 ore.
   Controllare la temperatura del gel. Un termometro gel può aiutare a controllare la giusta temperatura durante la corsa.

Processo il gel

1. Quando il fronte del colorante ha raggiunto la fine del gel messo il gel dalla camera bassa del buffer. Rimuovere il gel dalla camera e allentare i morsetti. Tirare fuori i distanziali e con attenzione dissimulare le lastre di vetro. Se necessario tagliare la parte superiore pozzetto contenente gel.
2. Con attenzione trasferire il gel in un piatto con una soluzione di gel di fissazione (stessa concentrazione di metanolo TBE più 5-10% ed etanolo). Lascia il gel nella soluzione per 5-10 minuti e cambia il buffer due volte.
3. Il gel è pronto per l'ulteriore elaborazione con essiccatore gel vuoto o la scansione diretta del gel.

Discussion

1. La nitidezza banda dipende da diversi fattori. Il volume di campione caricato per bande forte deve essere il più piccolo possibile, cioè idealmente tra 1-5 microlitri. Tuttavia, fino a 15 microlitri può essere caricato che assicura ancora la risoluzione accettabile. Meno volume risultati dei campioni in più nitide bande.
2. La qualità di banda dipende anche dallo spessore del gel. Diluente gel, come ad esempio 0,75 millimetri mostrano risultati migliori gel a 1,5 mm di spessore.
3. La forma delle bande può anche essere influenzato durante il caricamento in gel, se il campione non è applicata in modo uniforme nella tasca gel. Di cui 10% glicerolo nel buffer di caricamento aiuta durante il caricamento del gel e il campione affonda nel pozzo più facilmente.
4. Un altro potenziale problema che è collegato con il tampone di caricamento del campione può avvenire, se il prodotto atteso (s) corre allo stesso livello come uno dei coloranti di carico. Inoltre, se le etichette fluorescenti sono usati, alcuni coloranti mostrano un segnale fluorescente ad una lunghezza d'onda simile. Se questo è il caso, la rimozione di un colorante o di tutti i coloranti in grado di risolvere questo problema. Poi si consiglia di eseguire il colorante contenente campione in un pozzo vuoto come un formato standard.
5. Bassa tensione all'inizio della corsa aiuta anche ad ottenere più nitide le bande, come il campione entra nel frontale gel senza problemi ed evita che il collasso gel tasche a causa di alta tensione. Una bassa percentuale di acrilammide breve stacking gel (4%) può avere lo stesso effetto band-affilatura.
6. Un problema spesso riscontrato è gel "sorridente", che è dovuto alla distribuzione non uniforme di calore attraverso il gel durante l'elettroforesi. Se il gel non è circondato da buffer, che a seconda del sistema gel è impiegato, allegando una piastra metallica alla lastra di vetro supporta una equa distribuzione di calore e può aumentare notevolmente la qualità del gel.
7. Silanizzazione di lastre di vetro per le più grandi gel è consigliato, dato che migliora notevolmente la gestione di gel dopo la corsa, come i gel tendono ad attaccarsi alle lastre di vetro.

Denaturazione poliacrilammide gel elettroforesi urea (Urea-PAGE) è utile per analizzare o separare DNA a singolo filamento o di frammenti di RNA nonché campioni radionucleotide-o fluorescenti-etichettati.