小鼠颈动脉部分结扎诱导血流紊乱性动脉粥样硬化模型及颈动脉内皮细胞RNA简易提取方法

摘要

本文描述了一种部分颈动脉结扎手术，该手术可在小鼠颈总动脉中引起血流紊乱，并在两周内导致动脉粥样硬化形成，四周围内出现斑块内新生血管。我们还介绍了一种从颈动脉内膜分离RNA的新方法，可获得高纯度的内皮细胞RNA。

摘要

尽管已知血流紊乱与动脉粥样硬化之间存在密切关联，但将二者直接联系的实验证据一直缺乏。我们近期采用了一种改良的小鼠颈总动脉部分结扎方法[1,2]，证明该操作可在小鼠颈总动脉中急性诱导出低流速和振荡性血流状态，这两种特征正是紊乱血流的关键表现。利用这一模型，我们首次提供了直接证据，表明紊乱血流确实可导致载脂蛋白E基因敲除（Apolipoprotein E knockout）小鼠迅速而显著地发生动脉粥样硬化[3]。我们还建立了一种从小鼠颈动脉内膜高效分离高纯度血管内皮细胞RNA的方法[3]。通过该小鼠模型及方法，我们发现，在高脂血症小鼠模型中，部分结扎可在一周内引起内皮功能障碍，随后在两周内迅速形成明显的动脉粥样斑块；至四周时，已呈现出复杂的病变特征，例如斑块内新生血管形成。这一快速in vivo该模型和内皮细胞RNA制备方法可用于确定血流依赖性调控血管生物学及疾病背后的分子机制。此外，该方法还可用于测试针对内皮功能障碍和动脉粥样硬化的各种治疗干预措施，并显著缩短研究周期。

方案

1. 左颈动脉部分结扎

1. 使用约 8 周龄的小鼠。建议小鼠体重至少为 18 克。
2. 将器械在玻璃珠灭菌器中灭菌 30 秒，然后冷却。
3. 通过腹腔（i.p.）注射 Ketamine（80 mg/kg）和 Xylazine（10 mg/kg）诱导麻醉，或使用经 IACUC 批准的其他麻醉方法。进行腹腔注射时，应将小鼠左下腹象限作为注射部位。
4. 将小鼠置于加热舱内，直至完全麻醉。通过脚趾夹捏反应确认麻醉深度。
5. 将小鼠仰卧位（腹部朝上）固定于手术台上。用胶带将前肢掌面朝上、后肢足底朝下固定于手术台。
6. 在下颌与胸骨之间的颈部区域涂抹适量脱毛剂（例如 Nair），轻轻按摩直至所有毛发被去除。
7. 清除脱毛剂残留，并在脱毛区域涂抹足量的碘伏（Betadine）。
8. 准备若干段 1 英寸长的 6-0 丝线缝合线用于结扎。每只小鼠需要两段缝合线。
9. 使用锋利的小剪刀在颈部正中做 4–6 mm 的垂直切口。需同时切开皮肤及皮下筋膜。
10. 将左侧腮腺从正中线向左推开，在气管右侧开始钝性分离。此时应能清晰辨认搏动的左侧颈总动脉。
11. 沿颈总动脉向尾侧分离，直至找到其分叉处。
12. 钝性分离分叉区域，暴露左侧颈总动脉发出的以下四条远端分支：颈外动脉、颈内动脉、枕动脉和甲....

讨论

在此操作过程中，准确识别颈总动脉的所有分支（包括颈外动脉、颈内动脉、枕动脉和甲状腺上动脉）至关重要。同时，必须使用超声验证血流模式，如图所示。根据我们的经验，基于对500多只小鼠的超声研究，部分结扎手术的成功率超过90%。在进行颈动脉内膜RNA制备时，需特别注意首次灌注步骤后颈动脉的外观。如果此时发现左侧颈总动脉存在血流阻塞的迹象，建议不要将这些样本用于后续分析。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生理盐水（0.9% 氯化钠）	Baxter Internationl Inc.	2B1323
胰岛素注射器（3/10 ml，29G）	Tyco Healthcare, Covidien	8881600145
HBSS	Cellgro	21-023
miRNeasy mini 试剂盒（含 QIAzol）	Qiagen	217004
Vevo 770 高分辨率微型成像系统	VisualSonics, inc.	a.Visualsonics 770 系统 b.成像台 c.Vevo 集成导轨系统 d.小鼠用 RMV 扫描探头	或类似系统
6-0 丝线缝合线，无菌	Covidien	s-1172 c2
小型剪刀	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5675	或类似产品
解剖镊	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	或类似产品
Tissue Mend II	Webster Veterinary	07-856-7946