本文描述了一种部分颈动脉结扎手术，该手术可在小鼠颈总动脉中引起血流紊乱，并在两周内导致动脉粥样硬化形成，四周围内出现斑块内新生血管。我们还介绍了一种从颈动脉内膜分离RNA的新方法，可获得高纯度的内皮细胞RNA。
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本文内容
摘要
摘要
尽管已知血流紊乱与动脉粥样硬化之间存在密切关联，但将二者直接联系的实验证据一直缺乏。我们近期采用了一种改良的小鼠颈总动脉部分结扎方法[1,2]，证明该操作可在小鼠颈总动脉中急性诱导出低流速和振荡性血流状态，这两种特征正是紊乱血流的关键表现。利用这一模型，我们首次提供了直接证据，表明紊乱血流确实可导致载脂蛋白E基因敲除（Apolipoprotein E knockout）小鼠迅速而显著地发生动脉粥样硬化[3]。我们还建立了一种从小鼠颈动脉内膜高效分离高纯度血管内皮细胞RNA的方法[3]。通过该小鼠模型及方法，我们发现，在高脂血症小鼠模型中，部分结扎可在一周内引起内皮功能障碍，随后在两周内迅速形成明显的动脉粥样斑块；至四周时，已呈现出复杂的病变特征，例如斑块内新生血管形成。这一快速in vivo该模型和内皮细胞RNA制备方法可用于确定血流依赖性调控血管生物学及疾病背后的分子机制。此外，该方法还可用于测试针对内皮功能障碍和动脉粥样硬化的各种治疗干预措施，并显著缩短研究周期。
方案
1. 左颈动脉部分结扎
- 使用约 8 周龄的小鼠。建议小鼠体重至少为 18 克。
- 将器械在玻璃珠灭菌器中灭菌 30 秒，然后冷却。
- 通过腹腔（i.p.）注射 Ketamine（80 mg/kg）和 Xylazine（10 mg/kg）诱导麻醉，或使用经 IACUC 批准的其他麻醉方法。进行腹腔注射时，应将小鼠左下腹象限作为注射部位。
- 将小鼠置于加热舱内，直至完全麻醉。通过脚趾夹捏反应确认麻醉深度。
- 将小鼠仰卧位（腹部朝上）固定于手术台上。用胶带将前肢掌面朝上、后肢足底朝下固定于手术台。
- 在下颌与胸骨之间的颈部区域涂抹适量脱毛剂（例如 Nair），轻轻按摩直至所有毛发被去除。
- 清除脱毛剂残留，并在脱毛区域涂抹足量的碘伏（Betadine）。
- 准备若干段 1 英寸长的 6-0 丝线缝合线用于结扎。每只小鼠需要两段缝合线。
- 使用锋利的小剪刀在颈部正中做 4–6 mm 的垂直切口。需同时切开皮肤及皮下筋膜。
- 将左侧腮腺从正中线向左推开，在气管右侧开始钝性分离。此时应能清晰辨认搏动的左侧颈总动脉。
- 沿颈总动脉向尾侧分离，直至找到其分叉处。
- 钝性分离分叉区域，暴露左侧颈总动脉发出的以下四条远端分支：颈外动脉、颈内动脉、枕动脉和甲状腺上动脉。这些血管（尤其是甲状腺上动脉）较为脆弱，分离时需格外小心。
- 使用 6-0 丝线在甲状腺上动脉起始部上方结扎颈外动脉。操作时，用一把镊子从动脉下方穿过，借助另一把镊子夹取一段预先剪好的缝合线，轻柔地将缝线引过动脉下方。打结时应牢固，避免周围组织被缠入结中。若结扎位置位于甲状腺上动脉分支起点下方，则最终将导致完全性结扎，形成一种显著不同的模型。
- 使用相同技术，以单个结扎线同时结扎颈内动脉和枕动脉。
- 确认缝线位置正确，并检查甲状腺上动脉是否通畅。
- 对合皮肤切口，使用少量 Tissue-Mend 封闭皮肤。
- 将小鼠置于加热舱中直至苏醒。恢复时间通常为 30 至 60 分钟。
- 若所用麻醉方法无法提供持久镇痛（例如吸入式异氟烷），或动物在术后 24 小时内出现痛苦表现，应立即给予单剂量的布托啡诺（Buprenorphine，0.1 mg/kg）。根据我们的经验，当手术由经验丰富的操作者完成时，麻醉所用的 Ketamine 剂量已能提供足够的镇痛效果，无需额外使用镇痛药。
2. 颈动脉超声检查
- 为验证部分结扎是否诱导了紊乱血流，应在结扎术后一天检测颈动脉血流
- 使用异氟烷诱导麻醉——必要时可使用麻醉诱导箱
- 将麻醉后的小鼠仰卧位放置于成像平台
- 用胶带将小鼠四肢固定在成像平台的ECG传感器上
- 在颈部广泛涂抹Nair脱毛（此步骤仅在结扎手术时未进行脱毛的情况下需要）
- 插入直肠温度计以记录体温
- 在颈部涂抹超声耦合剂
- 首先使用B模式成像
- 成像平面应为90度（探头上的旋钮应指向小鼠鼻部）
- 将探头缓慢下放至小鼠颈部，直至获得图像
- 左右移动成像平台，直至识别到气管（中线结构）
- 识别左侧颈总动脉
- 倾斜成像平台，使成像平面与颈动脉之间形成一定角度。角度越大，多普勒信号越强
- 将脉冲波多普勒取样容积置于左侧颈总动脉中央
- 根据需要使用角度校正
- 在右侧颈总动脉重复上述测量
- 成功的部分颈动脉结扎将导致左侧颈总动脉血流较右侧显著减少（约减少80–90%），并在舒张期出现血流方向逆转，朝向主动脉入口
- 获得满意图像后，关闭麻醉气体，擦去小鼠身上的超声耦合剂，并解除胶带固定，将小鼠放入预热的恢复舱中
3. 颈动脉内膜RNA的分离
- 通过 CO 处死小鼠2 根据机构IACUC方案进行吸入处理
- 用胶带将足部固定在纸巾上。
- 从腹部到胸部顶端切开小鼠的皮肤。
- 用一把锋利的剪刀在肋骨下方切开腹壁。
- 用镊子提起胸骨，剪断膈肌，然后剪除外侧肋骨以暴露心脏。
- 用剪刀剪断下腔静脉。
- 通过左心室以含10 Units/mL肝素的生理盐水进行压力灌注（120 mmHg），持续2至3分钟，直至肺和肝脏变为苍白。
- 切开颈部皮肤，去除所有脂肪、肌肉和结缔组织，直至暴露颈动脉。
- 将小鼠置于解剖显微镜下。
- 在左侧颈总动脉结扎部位下方穿刺一个小孔，用于第二次灌注。
- 通过左心室用含有10 Units/mL肝素的生理盐水再次进行压力灌注约1分钟，确保左颈总动脉得到充分灌注。
- 使用精细尖头镊子和小型弹簧剪，仔细清除颈动脉周围附着的外膜组织。在清理过程中注意不要挤压或牵拉颈动脉。
- 在主动脉弓与颈动脉分叉上方的结扎点之间切断左侧颈总动脉。
- 在右锁骨下动脉分支点与颈动脉分叉之间切断右侧颈总动脉。
- 将颈动脉转移至含有冰冻HBSS的35 mm培养皿中。如有需要，小心去除残留的外膜周围组织。
- 使用29G针头的胰岛素注射器（3/10 ml注射器），抽取胰岛素 150 μl 每根颈动脉使用 QIAsol 裂解缓冲液（Qiagen）
- 小心地将针头尖端插入颈动脉的一端。
- 用镊子夹住颈动脉和针头尖端的同时，迅速（约1秒）冲洗QIAsol裂解缓冲液（150 μl) 转移至1.5 ml离心管中（内膜洗脱液）。
- 用HBSS冲洗颈动脉残留物（中膜+外膜）一次，放入1.5 ml离心管中，液氮速冻。
- 然后使用 miRNeasy mini 试剂盒（QIAGEN）按照制造商说明书，从内膜洗脱液及冷冻保存的剩余组织中分离内膜或中膜+外膜的 RNA。
4. 代表性结果：
我们对小鼠左侧颈总动脉进行了部分结扎，并在手术后一天进行超声检查。如图1所示，成功实施部分结扎后，在舒张期左侧颈总动脉内的血流速度降低并出现反向血流（紊乱血流）。载脂蛋白E基因敲除（KO）小鼠在接受高脂饮食的同时进行部分结扎，两周内即可在左侧颈总动脉（LCA）诱导出显著的动脉粥样硬化病变，而对侧右侧颈总动脉则无明显病变（图2）。从颈动脉内膜收集的RNA中含有内皮细胞标志基因（如PECAM-1），而不含中膜平滑肌细胞标志基因（如a-SMA）（图3）。
图1： 颈动脉解剖结构与结扎示意图： 左侧颈总动脉（LCA）的三个分支[颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）和枕动脉（OA）]被结扎，而甲状腺上动脉（STA）保持开放。
图2： 超声图像显示了血流速度分布，揭示部分结扎在舒张期引起LCA血流逆转（箭头所示）。结扎后RCA血流保持不变。
图3： 部分结扎结合高脂饮食可快速诱导ApoE基因敲除小鼠LCA发生动脉粥样硬化。 对ApoE基因敲除小鼠进行部分结扎并喂饲高脂饮食1至3周。对LCA的冷冻切片进行Oil-Red-O染色。
图4. 内膜RNA提取方法。 从假手术处理的C57BL/6小鼠右冠状动脉（RCA）和左冠状动脉（LCA）中分别获取内膜RNA及中膜+外膜（m+a）RNA。以18S作为内参，通过半定量RT-PCR (A) 和qPCR (B, C) 检测PECAM-1和α-SMA的表达。柱状图表示均值±标准误（SEM），n=3。
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讨论
在此操作过程中，准确识别颈总动脉的所有分支（包括颈外动脉、颈内动脉、枕动脉和甲状腺上动脉）至关重要。同时，必须使用超声验证血流模式，如图所示。根据我们的经验，基于对500多只小鼠的超声研究，部分结扎手术的成功率超过90%。在进行颈动脉内膜RNA制备时，需特别注意首次灌注步骤后颈动脉的外观。如果此时发现左侧颈总动脉存在血流阻塞的迹象，建议不要将这些样本用于后续分析。
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金资助，项目编号为HL87012（HJ）、HL75209（HJ）、UO1HL80711（DH、DG、HJ），以及韩国科技部和教育部世界一流大学项目（HJ）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生理盐水（0.9% 氯化钠） | Baxter Internationl Inc. | 2B1323 | |
| 胰岛素注射器（3/10 ml，29G） | Tyco Healthcare, Covidien | 8881600145 | |
| HBSS | Cellgro | 21-023 | |
| miRNeasy mini 试剂盒（含 QIAzol） | Qiagen | 217004 | |
| Vevo 770 高分辨率微型成像系统 | VisualSonics, inc. | a.Visualsonics 770 系统 b.成像台 c.Vevo 集成导轨系统 d.小鼠用 RMV 扫描探头 | 或类似系统 |
| 6-0 丝线缝合线，无菌 | Covidien | s-1172 c2 | |
| 小型剪刀 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5675 | 或类似产品 |
| 解剖镊 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | 或类似产品 |
| Tissue Mend II | Webster Veterinary | 07-856-7946 |
参考文献
- Korshunov, V. A., Berk, B. C. Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (12), 2185-2191 (2003).
- Sullivan, C. J., Hoying, J. B. Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (7), 1100-1105 (2002).
- Nam, D. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
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