Summary
El cordón umbilical se utilizan para aislar las células musculares lisas de diferentes maneras. En este trabajo se utilizó el tratamiento enzimático de células aisladas de músculo liso.
Abstract
El cordón umbilical humano (UC) es una muestra biológica que se puede obtener fácilmente justo después del nacimiento. Esta muestra biológica es que la mayoría de las veces, descartados y su cobro no implica ningún riesgo añadido para la salud del recién nacido o de s madre. Además, no se plantean problemas éticos. La UC está compuesto por una vena y dos arterias de la que tanto las células endoteliales (EC)
Protocol
- Las arterias son obtenidos a partir de piezas de la UC de 3.7 cm.
- Gelatina de Wharton que rodea a las arterias se retiró cuidadosamente cortando con unas tijeras.
- Una aguja de extremo romo de un diámetro exterior de 0,6-1mm se insertó unos 7 mm de un extremo de las arterias disecadas.
- Para quitar la sangre que queda dentro de los vasos, las arterias están en posición vertical y perfundidos con, aproximadamente de 20 a 40 ml, solución salina fisiológica (PSS), utilizando una jeringa de 20 ml conectada a una aguja. Si es necesario, este paso de lavado se repitió varias veces.
- El mismo procedimiento se repitió con RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Uno de los extremos de los vasos sanguíneos se cerró. Una jeringa de 10 mL se conectó a la aguja y perfundidos con 3 ml de colagenasa tipo I (800 unidades / ml en solución salina tamponada de Hank (HBSS)). Entonces el extremityof otro barco también fue cerrado.
- El buque se incubó con fosfato salino (PBS), durante 15 minutos a 37 ° C con agitación.
- Después de los extremos de la embarcación fueron cortadas para recoger el SMC libre. Las arterias se perfundir con aproximadamente 20 a 40 ml de DMEM-F12 suplementado con 5% de SFB y antibióticos a un tubo de 50 ml.
- El tubo fue centrifugado a temperatura ambiente (250 g, 8 min), y el sedimento celular se resuspendió en 5 ml de DMEM-F12 suplementado con 5% de FBS.
- La suspensión celular fue trasladado a un colágeno recubiertas T-frasco y se incuba a 37 ° C, con un 5% de CO2 atmósfera húmeda.
- Después de 5 16 h, las células no adherentes y drebis celulares fueron retirados, 5 ml de medio de cultivo y se añadió a las células fueron incubadas a 37 ° C, con un 5% de CO2 atmósfera húmeda.
- Los medios de cultivo celular se cambia cada 2 3 días, hasta que llegó a la confluencia SMC.
- Después de las células alcanzado confluencia que se sembraron en dos o tres de 25 cm 2 frascos T.
Limpieza
- Deseche las agujas en el contenedor de objetos punzantes.
- Deseche las jeringas en un recipiente grande de riesgo biológico.
- Ponga todos los tejidos en una bolsa de riesgo biológico pequeños. Cierre la bolsa y se congelan a -20 ° C hasta su incineración.
- Ponga todos los instrumentos en virucida por lo menos 10 min.
- Volver medios no utilizados a la nevera.
- Deseche los guantes de residuos biopeligrosos.
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Discussion
El SMC se puede utilizar como modelo para futuros ensayos con fármacos constrictor, para aislar y caracterizar la estructura tipo L-canales de calcio, para estudiar los aspectos celulares y moleculares de la función vascular y para su uso en la ingeniería de tejidos. SMC y EC son fundamentales para el desarrollo de nuevos biomateriales que se pueden utilizar en la producción de vasos sanguíneos semi sintéticos para su uso en seres humanos.
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Acknowledgments
El hospital Amato Lusitano, Castelo Branco en Portugal.
El hospital Sousa Martins, Guarda Portugal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
