Cryopreserving och Återställa av mänskliga iPS-celler med hjälp av Komplett Knockout Serum Byte Feeder-Free Medium

Summary

Detta protokoll beskriver detaljerat förfarande för cryopreserving mänskliga iPS-celler i Knockout SR frysförvaring medellång och återvinna dessa celler i fullständig Knockout SR Feeder Gratis (KSR-FF) medium eller feeder-baserade Knockout SR medium.

Abstract

Upptäckten 2006 att mänskliga och musfibroblaster kan programmeras att generera iPS-celler ^1-3 med kvaliteter anmärkningsvärt liknar embryonala stamceller har skapat en värdefull ny källa av pluripotenta celler för läkemedelsutveckling, cellterapi och grundforskning.

GIBCO media och reagens har legat i framkant av pluripotenta stamcellsforskning år. Knockout DMEM kompletteras med Knockout Serum Byte är medierna i valet för embryonala stamceller tillväxt och nu iPS cellodling ^3-9. Detta guldmyntfoten media system kan nu användas för feeder-fri kultur med tillägg av Knockout SR Growth Factor Cocktail.

Traditionella mänskliga ES och iPS cell metoder kultur kräver användning av mus eller människa fibroblast lager feeder eller matare med luftkonditionering medium. Dessa kultur metoder är arbetsintensiva, svåra att skala och det är svårt att hålla höfterna cellerna odifferentierade grund av odefinierade villkor. Invitrogen har utvecklat Knockout SR Cocktail Growth Factor så att du enkelt övergången höfterna och HES cellkulturer till feeder-fri och samtidigt bibehålla din användning av Knockout SR.

Protocol

OBS: För att bibehålla sterila odlingsbetingelser, är alla förfaranden i detta protokoll utföras med steril laboratoriesed och utföras i dragskåp huva.

Före start, se till att alla media är jämvikt till 37 ° C och lämpligt gasade.

Förbereda Geltrex-belagd kultur rätter

OBS: se bilaga för användningen av CELLstart belagda kultur rätter.

1. Tina en tub Geltrex (1 ml) långsamt vid 2-8 ° C och späd 1:100 den i 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Blanda lösningen försiktigt.
   
   Obs: Vissa iPS-cell-linjer kan kräva en annan Geltrex utspädning för optimal tillväxt. Se bilaga för alternativa spädningar.
2. Täck hela ytan på varje kultur maträtt med Geltrex (1 ml för en 35-mm maträtt, 1,5 ml för en 60-mm maträtt).
3. Försegla varje maträtt med Parafilm att förhindra uttorkning och inkubera disken under 1 timme vid 37 ° C.
   
   OBS: På denna punkt kan du lagra Geltrex-belagda kultur rätter vid 4 ° C i upp till en månad. Försegla varje maträtt med Parafilm för att förhindra att Geltrex från att torka ut.
4. Innan du använder, överföra Geltrex-belagda rätter till ett laminärt flöde huva och ge dem möjlighet att anta rumstemperatur (ca 1 timme).

Förbereda Komplett Feeder-Free Knockout SR Medium

1. För att förbereda 1 mL 10 mikrogram / ml Grundläggande FGF lösning, aseptiskt blanda komponenter som anges nedan. Alikvotera lösningen och förvara vid -20 ° C i upp till 6 månader.
   

   Grundläggande FGF	10 mikrogram
   D-PBS	990μL
   10% BSA	10 mikroliter

   
   Obs: BSA kan ersättas med HSA eller Knockout SR på samma koncentration.
2. För att förbereda 50 ml av 2 mg / ml Dispase lösning, aseptiskt blanda komponenter som anges nedan. Filtrera sterilisera lösningen och förvara vid 4 ° C i upp till 2 veckor.

   Dispase	100 mg
   D-PBS	50 ml

3. För att bereda 100 ml komplett Knockout SR Feeder-Free (KSR-FF) kombinerar aseptiskt de komponenter som anges i tabellen nedan.
   

   Komponent	Stock Koncentration	Slutlig koncentration	Volym
   Knockout DMEM/F12 (kat. nr. 12.660-012)	-	1X	76,8 ml
   GlutaMAX-I (kat. nr 35.050-061)	200 mm	2 mM	1 ml
   Knockout SR (kat. nr. 10.828-028)	-	20%	20 ml
   Knockout SR-GFC (kat. nr. A10580-01)	50X	1X	2 ml
   bFGF (kat. nr. PHG0024).	10 mikrogram / ml	20 ng / ml	200 mikroliter

   
   Du kan lagra KSR-FF medel vid 2-8 ° C i upp till en vecka.
4. Strax före pre-utjämnande hela medellång till temperatur och gaser, tillsätt aseptiskt erforderlig volym 2 merkaptoetanol (55 mm lager koncentration) för en 0,1 mM slutlig koncentration. Till exempel att bereda 100 ml av KSR-FF medelstora lägga 182 mikroliter av 55 mm 2-merkaptoetanol (1:550 utspädning) Alternativt kan två-merkaptoetanol läggas till 1X färdig medium och förvaras vid 2-8 ° C i upp till en vecka.

Förbereda Frysning / Frysförvaring Medium

Den frysförvaring mediet består av två medier, Frysning Medium A och Frysning Medium B. De läggs till de celler vid olika tidpunkter och måste förbli åtskilda. De är vardera 50% av den totala volymen av Frysförvaring Medium behövs. Den totala volymen av Frysförvaring behövs Medium är 1 ml för varje flaska som skall frysas. En 90% konfluenta 60mm fat hESC kan användas för att bank 2 injektionsflaskor med hESC i frysförvaring medier.

Förbered tillräckligt med volym för varje Frysa Medium med en extra 2-5 ml för att säkerställa överskott.

Frysning Medium A (50% av slutlig volym):	50% DMEM/F12	50% KSR
Frysning Medium B (50% av slutlig volym):	80% DMEM/F12	20% DMSO

Exempel:

Om du är frysning 20 flaskor av celler, behöver du 20ml i Frysförvaring Medium. Lägg 4ml för översatsning för totalt 24ml Frysförvaring Medium. Det innebär att du kommer att behöva 12ml av frysning Medium A (50% av 24ml) och 12ml av frysning Medium B (50% av 24ml).

Frysning Medium A (12 ml):	6 ml DMEM/F12	6 ml KSR
Frysning Medium B (12 ml):	9,6 mL DMEM/F12	2,4 ml DMSO

Den slutliga sammansättningen av Frysförvaring Medium är 65% DMEM/F12, 25% KSR, och 10% DMSO.

Cryopreserving iPSCs

1. Förvärma erforderlig volym Dispase i ett 37 ° C vattenbad. Se tabell 1 nedan för information om volymer som behövs.
2. Pre-jämvikt erforderlig volym KSR-FF i 37 ° C vattenbad for15 min. Se tabell 1below för information om volymer som behövs.
3. Aspirera det använda mediet från den kultur fartyget med hjälp av en pipett och spola cellerna två gånger med D-PBS.
4. Tillsätt försiktigt förvärmda Dispase lösning på den kultur fartyget (t.ex. 1 ml Dispase lösning per 60-mm kultur maträtt). Snurra kultur fartyget att belägga hela cellytan.
5. Inkubera kulturen fartyget vid 37 ° C i 3 minuter.
6. Ta bort fartyget från inkubatorn, aspirera Dispase lösningen, och försiktigt tvätta cellerna med D-PBS.
7. Försiktigt skrapa cellerna på ytan av den kultur maträtt med hjälp av en cell skrapa, och överföra celler till en steril 15 ml centrifugrör.
8. Skölj kulturen skålen två gånger med KSR-FF, försiktigt "sprutning av" alla celler som inte har lossnat. Pool skölj mediet med celler i 15ml tub.
9. Centrifugera röret vid 200 xgi 5 minuter vid rumstemperatur till pellets cellerna.
10. Försiktigt aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten och kassera den.
11. Förbered en tillräcklig mängd cryovials. När cellerna är i kontakt med DMSO, bör de alikvoteras och djupfrysta inom 2-3 minuter.
12. Knacka försiktigt på röret, att helt lösgöra cellpelleten från tuben botten och återsuspendera cellerna i Frysning Medium A. [genom att försiktigt pipettera upp och ner med en 5-mL serologisk pipett]. Efter enhetlig suspension av klumpar, tillsätt lika volym frysa Medium B till den, i en droppe klokt sätt, samtidigt försiktigt virvlande cellsuspensionen att blanda.
    
    Anm: Vid denna punkt, celler är i kontakt med DMSO, och arbetet måste utföras effektivt. När cellerna är i kontakt med DMSO, bör de alikvoteras och djupfrysta inom 2-3 minuter.
13. Alikvotera 1 ml av cellsuspensionen i varje cryovial.
14. Snabbt Placera rören i en Mr Frosty [att snabbt frysa] och överföra den till -80 ° C över natten.
15. Efter övernattning förvaring vid -80 ° C, överföra celler till en flytande kväve tank för långtidsförvaring.

IPSC flaskan tina och cell återhämtning

Notera: KSR-FF kan ersättas med KSR-innehållande MEF-betingad medium eller KSR medium för användning med matare. Se bilaga för instruktioner för media beredning.

Pre-varm 10mL av KSR-FF medium i ett 50 ml rör.

1. Jämvikta en lämplig mängd av Geltrex-belagda rätter till rumstemperatur och aspirera vätska från disken precis innan plätering dur celler.
2. Ta försiktigt bort hESC (eller IPSC) injektionsflaskan från flytande kväve ackumulatortank.
3. Snabbt tina frusna injektionsflaska med celler i ett 37 ° C vattenbad, tills bara en liten frusen bit kvar i flaskan.
4. Spray flaska med 70% isopropanol att sanera den och överföra den till den sterila vävnadsodling huva.
5. Överför aseptiskt upp hela innehållet i flaskan i en 15 ml koniska rör med hjälp av en 5 ml-pipetten.
6. Skölj flaskan med 1 ml KSR-FF och lägga detta till 15 ml centrifugrör.
7. Långsamt Tillsätt 4 ml av KSR-FF droppvis till celler i 15ml koniska röret. Medan lägga mediet, rör försiktigt röret fram och tillbaka för att blanda celler. (Detta minskar osmotiska chock för cellerna).
8. Centrifugera 15 ml tub med cellsuspension vid 1000rpm (200 x g) i 2 minuter i rumstemperatur.
9. Noggrant Aspirera och kassera supernatanten utan att störa cellpelleten.
10. Återsuspendera cellpelleten i förvärmda KSR-FF (t.ex. 4mL/60 mm maträtt) med hjälp av en 5 ml-pipetten och försiktigt pipettera cellerna upp och ner tills cellpelleten är helt utspridda. En livskraft mer än 70% förväntas, men om lönsamheten är lägre än 70%, kan det ta längre tid för cellerna att nå sammanflödet.
11. Med samma pipett cellsuspensionen droppvis till Geltrex-belagda kultur maträtt före återfå rumstemperatur.
12. Placera kulturen skålen i en 37 ° C inkubator, med en fuktig atmosfär av 4 till 6% CO ₂ i luften. Försiktigt snurra fartyg i en norr till söder, öst till väst mönster för att jämnt fördela celler.
13. Försiktigt vätskefyllda ändra kulturen skålen 24 timmar efter tina och dagligen därefter att ta bort cellfragment och ge färska näring tills skålen är ca 70-80% konfluenta. För fortsatt kultur och passaging av iPS-celler, se våra protokoll med titeln "feeder-fri kultur och Passaging av mänskliga iPS-celler med hjälp av Komplett Knockout Serum Byte Feeder-Free Medium"

Förväntade resultat

Cellerna bör vara ungefär 70-80% konfluenta före frysförvaring. Dispase matsmältningen resulterar i curling upp och infällning av kolonier längs kolonin marginaler. Efter skörd de celler som de är frysta som små klumpar i frysförvaring medier. När injektionsflaskan har tinat, celler återhämta sig och fäster vid pre-belagda maträtt som små klumpar. De växer snabbt leder till ett sammanhängande skålen i 5-6 dagar.

Tabell 1 - Rekommenderade Volymer

Komponent	35mm Dish	60mm Dish	100mm Dish
Komplett Knockout SR medelstora	2 ml	4 mL	10 ml
Geltrex Lösning	1 ml	1,5 ml	4-5 mL
Dispase	0,5 ml	1 ml	3-4 mL
D-PBS för sköljning	2 ml	4 mL	10 ml

Vänligen klicka här för att se appendix .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)
KnockOut Serum Replacement		10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		21985-023
Dispase		17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		14190-144
DMSO, 500mL	JT Baker	JT9224-1
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60 mm Tissue Culture treated dishes
Liquid nitrogen storage tank
Isopropanol freezing containers
1.5 mL Cryovials