Cryopreserving와 인간 IPS 세포 복구 완료 마네에게 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여

Summary

이 프로토콜은 녹아웃 SR의 cryopreservation 매체 인간의 IPS 세포를 cryopreserving 완벽한 마네 SR 공급기 무료 (KSR - FF) 중간 또는 피더 기반 마네의 SR 매체에서 이러한 세포를 복구하는 자세한 절차를 설명합니다.

Abstract

인간과 마우스 섬유아 세포가 배아 줄기 세포에 상당히 유사 자질을 가진 ^1-3 IPS 세포를 생성하는 재설정 될 수 있다고 2006 년에 발견은 약물 발견, 세포 치료와 기초 연구를위한 pluripotent 세포의 중요한 새로운 소스를 만들었습니다.

GIBCO 미디어 및 시약 년 동안 pluripotent 줄기 세포 연구의 선두에있다. DMEM가 마네 세럼 교체와 보충 마네는 배아 줄기 세포의 성장과 지금은 IPS 세포 배양 ^3-9위한 최고의 매체입니다. 이 황금 표준 미디어 시스템은 이제 마네의 SR 성장 팩터 칵테일의 추가와 함께 피더 무료 문화 사용할 수 있습니다.

전통적인 인간의 ES와 IPS의 세포 배양 방법은 마우 스나 인간 fibroblast 피더 레이어의 사용 또는 피더 - 에어컨 매체를 필요로합니다. 이러한 문화 방법은 규모에 노동 집약, 하드 있으며, 그것은 정의되지 않은 상황으로 인해 undifferentiated 허리의 세포를 유지하기 어렵습니다. Invitrogen은 여전히​​ 마네의 SR의 사용을 유지하면서 쉽게 전환하여 엉덩이와 hES 세포 문화를 피더없는 수 있도록 마네의 SR 성장 팩터 칵테일을 개발했습니다.

Protocol

참고 : 무균 문화 조건을 유지하기 위해서는이 프로토콜의 절차를 모두 무균 실험실 방법을 사용하여 수행하고 층류 후드 아래에 실시하고 있습니다.

시작하기 전에, 모든 미디어는 37 equilibrated되도록 ° C 적절하게 기름.

Geltrex - 코팅 문화 요리를 준비

참고 : CELLstart 코팅 문화 요리의 사용을 위해 부록을 참조하십시오.

1. 해동 한 천천히 2-8에서 Geltrex (1 ML) ° C의 튜브 및 넉아웃 D-MEM/F-12 99 ML에 1:100 그것을 희석. 부드럽게 솔루션을 섞는다.
   
   참고 : 일부 IPS 세포 라인은 최적의 성장을 위해 다른 Geltrex 희석이 필요할 수 있습니다. 대체 dilutions에 대한 부록을 참조하십시오.
2. Geltrex 솔루션 (35 - mm 요리 1 ML, 60 mm 요리 1.5 ML) 각 문화 요리의 전체 표면을 커버.
3. 건조를 방지하고 37에서 1 시간 동안 요리를 부화 Parafilm 각 접시 ° C. 봉쇄해
   
   참고 : 최대 1 개월이 지점에서 4 ° C에서 Geltrex - 코팅 문화 요리를 저장할 수 있습니다. 밖으로 건조에서 Geltrex을 방지하기 위해 Parafilm 각 요리를 밀봉합니다.
4. 이전 사용하기 층류 후드에 Geltrex - 코팅 요리를 전송하고는 실온 (약 1 시간)에 평형 수 있습니다.

완료 녹아웃의 SR 공급기 - 무료 매체를 준비

1. 10 μg / ML 기본 FGF 솔루션 1 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. -20 ° C에서 나누어지는 솔루션 및 저장 최대 6 개월까지.
   

   기본 FGF	10 μg
   D - PBS	990μL
   10% BSA	10 μL

   
   참고 : BSA는 같은 농도에서 HSA 또는 넉아웃의 SR로 대체 수 있습니다.
2. 2 MG / ML Dispase 솔루션의 50 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. 4 솔루션 및 저장 ° C 최대 2 주 동안을 소독 필터.

   Dispase	100 MG
   D - PBS	50 ML

3. 전체 녹아웃의 SR 100 ML를 준비하는 피더 - 무료 (KSR - FF)는 무균 아래 표에 나와있는 구성 요소를 결합.
   

   구성 요소	주식 농도	최종 농도	음량
   마네 DMEM/F12 (Cat. 번호. 12660-012)	-	1X	76.8 ML
   GlutaMAX - I (Cat. 번호 35050-061)	200 MM	2 MM	1 ML
   녹아웃 SR (Cat. 번호. 10828-028)	-	20%	20 ML
   녹아웃 SR - GFC (Cat. 번호. A10580 - 01)	50X	1X	2 ML
   bFGF (Cat. 번호. PHG0024).	10 μg / ML	20 NG / ML	200 μL

   
   최대 일주일을 위해 당신은 2-8 ° C에서 KSR - FF 매체를 저장할 수 있습니다.
4. 온도와 가스의 전체 매체를 미리 equilibrating 바로 전에 무균 0.1 MM 최종 농도 2 메르 캅 토 에탄올의 필요한 볼륨 (55 MM 주식 농도)을 추가합니다. 예를 들어, KSR - F 100 ML를 준비하는F 매체 2 - 메르 캅 토 에탄올 (1:550 희석) 또는 55 mm의 182 μL를 추가, 2 - 메르 캅 토 에탄올은 1X 완료 매체에 추가 및 최대 일주일 동안 2-8 ° C에 저장된 수 있습니다.

냉동 / Cryopreservation 중간 준비

cryopreservation 매체는 두 미디어로 구성되어, 냉동 매체는 A와 동결 매체 B.는 그들은 다른 시간에 세포에 추가되고 남아 분리해야합니다. 그들은 각 Cryopreservation 매체의 전체 볼륨의 50 %가 필요합니다. 필요한 Cryopreservation 매체의 총 부피는 냉동으로 각 유리병 1 ML입니다. hESC의 90% 합류 60mm 요리는 cryopreservation 미디어에 hESC 은행이 유리병하는 데 사용할 수 있습니다.

없더군요을 보장하기 위해 추가 2 5mL 각 냉동 매체의 충분한 볼륨을 준비합니다.

냉동 중간 (최종 볼륨의 50 %)	50% DMEM/F12	50 % KSR
냉동 중간 B (최종 부피의 50 %)	80% DMEM/F12	20% DMSO

예 :

이 세포의 20 튜브를 동결하는 경우 Cryopreservation 매체 20mL가 필요합니다. 24mL Cryopreservation 매체의 총 없더군요에 대한 4mL를 추가합니다. 당신은 냉동 매체의 12mL가 필요합니다 즉 A (24mL의 50 %)과 동결 매체 B (24mL의 50 %)의 12mL.

냉동 중간 (12 ML) :	6 ML DMEM/F12	6 ML KSR
냉동 중간 B (12 ML) :	9.6 ML DMEM/F12	2.4 ML DMSO

Cryopreservation 매체의 최종 구성 65 % DMEM/F12, 25 % KSR하고, 10 % DMSO입니다.

Cryopreserving iPSCs

1. 37 ° C의 물을 욕조에 Dispase 사전 따뜻한 필요한 볼륨. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오.
2. 37 ° C의 물 목욕 for15 분에 KSR - FF의 필요한 볼륨을 사전에이 - 평형. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 테이블 1below을 참조하십시오.
3. 피펫을 사용하여 문화 선박에서 보낸 매체를 대기음하고, D - PBS로 두 번 세포를 씻어.
4. 부드럽게 문화 선박 (예, 60 mm 문화 요리 당 Dispase 솔루션 1 ML)로 사전 예열 Dispase 솔루션을 추가합니다. 코트 전체 세포 표면에 소용돌이 문화 우주선합니다.
5. 3 분 37 ° C에서 문화 함선을 품어.
6. 인큐베이터에서 혈관을 제거 Dispase 솔루션을 기음, 부드럽게 D - PBS로 세포를 씻어.
7. 부드럽게 세포 스크레이퍼를 사용하여 문화 접시의 표면에서 세포를 긁어 및 살균 15mL 원심 튜브에 세포를 전송합니다.
8. 부드럽게 분리하지 않은 세포를 "해제 분사.", KSR - FF로 두 번 문화 접시를 씻어 수영장은 15mL 튜브에 세포와 매체를 씻어.
9. 상온에서 펠릿 세포 5 분 200 XG에서 튜브를 원심 분리기.
10. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 대기음하고 폐기.
11. cryovials의 충분한 수량을 준비합니다. 세포 DMSO와 연락되면, 그들은 aliquoted 후 2-3 분 이내에 냉동해야합니다.
12. 천천히 완벽하게 [부드럽게까지 pipetting 아래 5 ML serological 피펫을 사용하여 소리] 튜브 바닥에서 세포 펠렛을 이동시키다 및 냉동 매체 A.에있는 세포를 다시 정지, 튜브를 버려. 부드럽게 혼합에 세포 현탁액을 소용돌이 치는 동안 대단히 짧은 시간의 균일한 현탁액에 따라, 한 방울 현명한 방식으로, 그것 동결 매체 B의 같은 볼륨을 추가합니다.
    
    참고 :이 시점에서, 세포가 DMSO와 연락하고, 작업이 효율적으로 수행되어야합니다. 세포 DMSO와 연락되면, 그들은 aliquoted 후 2-3 분 이내에 냉동해야합니다.
13. 각 cryovial에 세포 현탁액의 나누어지는 1 ML.
14. 신속 [급속 동결] 미스터 프로 스티에 튜브를 넣고 ° C -80 하룻밤에 전송할 수 있습니다.
15. -80에서 하룻밤 보관하면 ° C는 장기 저장을위한 액체 질소 탱크에 세포를 전송합니다.

iPSC의 유리 해동 및 세포 복구

참고 : KSR - FF는 KSR 함유 MEF - 시설 중간, 또는 피더와 함께 사용하기위한 KSR 매체로 대체될 수 있습니다. 미디어 준비하기위한 지침은 부록을 참조하십시오.

50 ML 튜브에 KSR - FF 매체 사전 따뜻한 10mL.

1. 당신을 도금하기 전에 실내 온도에 Geltrex - 코팅 요리의 적절한 수량 평형과 요리로부터 액체를 기음R 세포.
2. 조심스럽게 hESC (또는 iPSC) 액체 질소 저장 탱크에서 약병을 제거하십시오.
3. 단지 작은 냉동 덩어리가 유리병에 남아 때까지 빠르게, 37 ° C의 물을 욕조에 세포의 냉동 병을 해동.
4. 그것을 오염을 제거하다하고 멸균 조직 문화 후드로 전송하는 이소프로판올 70%로 병을 스프레이.
5. 무균 5 ML의 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 관에 유리병의 전체 내용을 전송합니다.
6. KSR - FF 1 ML로 병을 씻어 15 ML의 원심 관에 이것을 추가합니다.
7. 천천히, KSR - FF 4 ML 15mL 원뿔 튜브에 세포 드롭 현명한를 추가합니다. 미디어를 추가하는 동안 부드럽게 세포를 섞어 앞뒤로 튜브를 이동합니다. (이것은 세포 삼투 충격을 줄일 수).
8. 15 ML 튜브 실온에서 2 분 동안 1000rpm (200 X G)의 세포 현탁액을 원심 분리기로.
9. 조심스럽게 기음과 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는 폐기하십시오.
10. 사전 예열 KSR - FF의 세포 펠릿 (예 4mL/60 mm 요리) 5 ML 피펫을 사용하고 세포 펠릿가 완전히 분산 때까지 부드럽게 세포를 피펫 아래 다시 일시 중지합니다. 생존 적은 70 %면 이상 70 % 생존이 예상된다, 그러나, 그것은 합류에 도달하는 세포를 위해 더 많은 시간이 소요될 수 있습니다.
11. 같은 피펫을 사용하여 세포 현탁액 실온에 미리 equilibrated Geltrex - 코팅 문화 요리 드롭 현명한를 전송합니다.
12. 공기 4-6%의 CO _2의 humidified 분위기, 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 놓습니다. 고르게 세포를 배포 서부 패턴 남쪽, 동쪽 북쪽 신중하게 소용돌이 모양의 용기.
13. 부드럽게 문화 접시를 유체 - 변경 24 시간 이후 해동와 세포 부스러기를 제거하고 요리는 약 70-80% 합류하기 전까지 신선한 영양소를 제공하기 위해 이후 매일.이 귀하의 IPS 세포의 지속적인 문화와 passaging 들어, "완료 마네 세럼 교체 사용하는 인간의 IPS 세포 피더 - 무료 문화 Passaging 피더를 무료 매체"라는 제목의 프로토콜을 참조하십시오

예상 결과

세포 전에 cryopreservation에 합류 약 70~80%되어야합니다. 최대 컬링과 식민지 마진 따라 식민지의 접이식의 소화 결과를 Dispase. 세포를 수확 후 그들은 cryopreservation 미디어의 작은 대단히 짧은 시간으로 냉동 있습니다. 유리병가 해동되면 세포가 회복 작은 대단히 짧은 시간으로 미리 코팅 요리에 첨부합니다. 그들은 급속하게 5-6일에 합류 접시에 선도적인 성장.

표 1 - 추천 볼륨

구성 요소	35mm 디시	60mm 디시	100mm 디시
완료 녹아웃 SR 미디어	2 ML	4 ML	10 ML
Geltrex 솔루션	1 ML	1.5 ML	4-5 ML
Dispase	0.5 ML	1 ML	3-4 ML
rinsing을위한 D - PBS	2 ML	4 ML	10 ML

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Knockout DMEM/F12		12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)
KnockOut Serum Replacement		10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail		A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg		PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercapt–thanol		21985-023
Dispase		17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL		A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium		14190-144
DMSO, 500mL	JT Baker	JT9224-1
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60 mm Tissue Culture treated dishes
Liquid nitrogen storage tank
Isopropanol freezing containers
1.5 mL Cryovials