Summary
Este protocolo describe el procedimiento detallado para criopreservar las células iPS humanas en el medio de criopreservación golpe de gracia SR y la recuperación de estas células en el golpe de gracia completa alimentador gratis SR (KSR-FF) a medio o en el alimentador medio basado golpe de gracia SR.
Abstract
El descubrimiento en 2006 de que los fibroblastos humanos y de ratón podría ser reprogramado para generar células iPS de 1-3 con cualidades muy similares a las células madre embrionarias ha creado una nueva y valiosa fuente de células pluripotentes para el descubrimiento de fármacos, la terapia celular y la investigación básica.
Los medios de comunicación GIBCO y reactivos han estado a la vanguardia de la investigación de células madre pluripotentes de años. Nocaut DMEM suplementado con suero de reemplazo golpe de gracia es el medio de elección para el crecimiento de células madre embrionarias, y ahora el cultivo de células iPS 3-9. Este estándar de oro del sistema de medios ahora se puede utilizar para alimentación libre de la cultura con la adición de cóctel golpe de gracia SR factor de crecimiento.
ES humanas tradicionales y los métodos de cultivo de células iPS requieren el uso de ratón o humano capas de fibroblastos de alimentación o el alimentador de medio condicionado. Estos métodos de cultivo son mano de obra, difícil de escalar y que es difícil mantener las células indiferenciadas caderas debido a las condiciones indefinido. Invitrogen ha desarrollado SR golpe de gracia crecimiento Cocktail factor que le permite una fácil transición de las caderas y las culturas hES celular para alimentación libre, manteniendo el uso de SR golpe de gracia.
Protocol
Nota: Para mantener condiciones estériles cultura, todos los procedimientos descritos en este protocolo se realiza mediante prácticas de laboratorio y estériles a cabo bajo una campana de flujo laminar.
Antes de comenzar, asegúrese de que cualquier medio es equilibrado a 37 ° C y adecuadamente el gas.
Preparación Geltrex recubierto placas de cultivo
Nota: véase el apéndice para el uso de CELLstart placas de cultivo revestidas.
- Descongelar un tubo de Geltrex (1 mL) lentamente a 2-8 º C y se diluye 1:100 en 99 ml de golpe de gracia D-MEM/F-12. Mezcle la solución suavemente.
Nota: Algunas líneas de células iPS pueden requerir una dilución diferente Geltrex para un crecimiento óptimo. Véase el apéndice para las diluciones alternativa. - Cubrir toda la superficie de cada placa de cultivo con la solución Geltrex (1 ml por un plato de 35 mm, 1,5 ml de un plato de 60 mm).
- Sello de cada plato con Parafilm para evitar la sequedad y se incuban las placas durante 1 hora a 37 ° C.
Nota: En este punto usted puede almacenar las placas de cultivo Geltrex recubierto a 4 ° C durante un máximo de un mes. Sello de cada plato con Parafilm para evitar la Geltrex se seque. - Antes de usar, la transferencia de los platos Geltrex recubierto con una campana de flujo laminar y permitir que alcancen la temperatura ambiente (alrededor de 1 hora).
Preparación del alimentador de Libre Completo SR golpe de gracia Media
- Para preparar 1 ml de 10 mg / ml de solución FGF básico, asépticamente mezclar los componentes enumerados a continuación. Alícuota de la solución y almacenar a -20 ° C hasta por 6 meses.
FGF básico 10 mg D-PBS 990μL 10% de BSA 10 l
Nota: BSA se puede sustituir con HSA o SR golpe de gracia a la misma concentración. - Para preparar 50 ml de solución de 2 Dispasa mg / ml, asépticamente mezclar los componentes enumerados a continuación. Filtro de esterilización de la solución y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
Dispasa 100 mg D-PBS 50 ml - Para preparar 100 mL de SR anulación completa del alimentador-Free (KSR-FF) asépticamente combinar los componentes que figuran en la tabla de abajo.
Componente Concentración de la La concentración final Volumen Nocaut DMEM/F12 (cat. n °. 12660-012) - 1X 76.8 mL Glutamax-I (Cat. N º 35.050-061) 200 mM 2 mM 1 mL SR golpe de gracia (art. no. 10.828-028) - 20% 20 ml Golpe de gracia SR-GFC (cat. n °. A10580-01) 50 veces 1X 2 mL bFGF (cat. n °. PHG0024). 10 mg / ml 20 ng / mL 200 l
Puede almacenar el medio KSR-FF a 2-8 º C durante un máximo de una semana. - Justo antes de pre-equilibrar el medio completo a la temperatura y gases, añadir asépticamente el volumen requerido de 2-mercaptoetanol (55 mM de concentración) para una concentración de 0,1 mM final. Por ejemplo, para preparar 100 ml de KSR-FMedio F añadir 182 l de 55 mM 2-mercaptoetanol (1:550 dilución) Por otra parte, el 2-mercaptoetanol puede ser añadido al medio 1X completaron y se almacenaron a 2-8 ° C durante un máximo de una semana.
Preparación de congelación / Criopreservación Media
El medio de criopreservación se compone de dos medios de comunicación, medio de congelación A y B. medio de congelación Se añaden a las células en diferentes momentos y deben permanecer separados. Son cada uno el 50% del volumen total del medio de criopreservación es necesario. El volumen total del medio de criopreservación se necesita 1 ml por cada vial a congelar. Un 90% confluentes plato de 60 mm de células madre se pueden utilizar para el banco 2 viales de células madre en los medios de criopreservación.
Preparar un volumen suficiente de cada medio de congelación con un extra de 2 5 ml para asegurar exceso.
| Congelación Medio A (50% del volumen final): | 50% DMEM/F12 | 50% KSR |
| Congelación medio B (50% del volumen final): | 80% DMEM/F12 | 20% DMSO |
Ejemplo:
Si se congelan 20 viales de células, tendrá 20 ml de medio de criopreservación. Agregar 4 ml por exceso por un total de medio Criopreservación 24ml. Eso significa que usted necesitará 12 ml de un medio de congelación. (50% de 24ml) y 12 ml de B medio de congelación (50% de 24ml)
| Congelación Medio A (12 ml): | 6 mL DMEM/F12 | 6 mL KSR |
| Congelación medio B (12 ml): | 9,6 ml de DMEM/F12 | 2,4 ml de DMSO |
La composición final de la media La crioconservación es un 65% DMEM/F12, el 25% KSR, y el 10% de DMSO.
Criopreservar CMPi
- Pre-caliente el volumen necesario de Dispasa en un baño de agua a 37 ° C. Consulte la Tabla 1 a continuación para obtener información sobre los volúmenes requeridos.
- Pre-equilibrar el volumen requerido de KSR-FF en un baño de agua 37 ° C for15 min. Consulte la tabla 1below para obtener información sobre los volúmenes requeridos.
- Aspirar el medio transcurrido desde el recipiente de cultivo con una pipeta, y aclarar las células dos veces con D-PBS.
- Suavemente agregar precalentado Dispasa solución al recipiente de cultivo (por ejemplo, 1 ml de solución Dispasa por placa de cultivo de 60 mm). Agitar el recipiente de cultivo para cubrir la superficie entera de la célula.
- Incubar el recipiente de cultivo a 37 ° C durante 3 minutos.
- Retire el vaso de la incubadora, se aspira la solución Dispasa, y lavar suavemente las células con D-PBS.
- Raspe suavemente las células de la superficie de la placa de cultivo con un rascador de células, y la transferencia de las células a un tubo de centrífuga de 15 ml estéril.
- Enjuague la placa de cultivo en dos ocasiones con KSR-FF, con suavidad "pulverización de" cualquier célula que no se han desprendido. La piscina del enjuague medio con las células en el tubo de 15 ml.
- Centrifugar el tubo a 200 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente para precipitar las células.
- Con cuidado, aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular y lo descarta.
- Preparar una cantidad suficiente de crioviales. Una vez que las células están en contacto con DMSO, que debe ser en alícuotas y congelado a los 2-3 minutos.
- Agitar suavemente el tubo, para desalojar completamente el pellet de células de la parte inferior del tubo y volver a suspender las células en medio de congelación A. [pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con un niño de 5 ml pipeta serológica]. Tras la suspensión uniforme de los grumos, agregar el mismo volumen de medio de congelación B a la misma, de manera gota a gota, mientras se agita suavemente la suspensión celular para mezclar.
Nota: En este punto, las células están en contacto con DMSO, y el trabajo debe realizarse de manera eficiente. Una vez que las células están en contacto con DMSO, que debe ser en alícuotas y congelado a los 2-3 minutos. - Alícuota de 1 ml de la suspensión celular en cada criovial.
- Rápidamente coloque los tubos en un Frosty el Sr. [para congelar rápidamente] y su transferencia a -80 ° C durante la noche.
- Después de almacenamiento durante la noche a -80 ° C, la transferencia de las células a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
IPSC deshielo vial y recuperación de las células
Nota: KSR-FF puede ser reemplazado por KSR-MEF-que contiene un medio condicionado, o medio KSR para su uso con los alimentadores. Véase el apéndice para obtener instrucciones para la preparación de los medios de comunicación.
Pre-caliente 10 ml de KSR-FF medio de un tubo de 50 ml.
- Equilibre la cantidad apropiada de Geltrex recubierto platos a la temperatura ambiente y se aspira el líquido de los platos antes de recubrimiento quer las células.
- Retire con cuidado la células madre (o IPSC) frasco de líquido del tanque de almacenamiento de nitrógeno.
- Rápido deshielo vial congelado de células en un baño de agua 37 ° C, hasta que sólo una parte pequeña se mantiene congelado en el vial.
- Rocíe vial con 70% de isopropanol para descontaminar y su transferencia a la capilla de cultivo de tejido estéril.
- Transferir asépticamente todo el contenido del vial en un tubo cónico de 15 ml con una pipeta de 5 ml.
- Enjuague el vial con 1 mL de KSR-FF y agregue esto a la del tubo de centrífuga de 15 ml.
- Poco a poco, añadir 4 ml de KSR-FF, gota a gota a las células en el tubo cónico de 15 ml. Al tiempo que añade el medio, mueva suavemente el tubo de ida y vuelta a mezclar las células. (Esto reduce el choque osmótico de las células).
- Centrifugar el tubo de 15 ml con la suspensión celular a 1000 rpm (200 x g) durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Con cuidado aspirar y descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular.
- Vuelva a suspender el pellet de células en el pre-calentado KSR-FF (por ejemplo, 4mL/60 plato mm) con una pipeta de 5 ml y pipeta suavemente las células de arriba a abajo hasta que el sedimento celular está totalmente dispersa. A la viabilidad de más del 70% que se espera, sin embargo, si la viabilidad es inferior al 70%, puede tomar más tiempo para que las células para llegar a la confluencia.
- Utilizando la misma pipeta, transferir la suspensión celular, gota a gota a la placa de cultivo Geltrex recubierto antes de alcanzar la temperatura ambiente.
- Coloque el plato de cultivo en una incubadora a 37 ° C, con una atmósfera húmeda de CO 4 al 6% 2 en el aire. Cuidadosamente remolino en un vaso de norte a sur, de este a oeste patrón para distribuir uniformemente las células.
- Suavemente el líquido de cambio de la placa de cultivo de 24 horas después de la descongelación y posteriormente a diario para eliminar los desechos celulares y para proporcionar los alimentos frescos hasta que el plato es de aproximadamente 70-80% confluente. Para el cultivo continuado y pases de las células iPS, se refieren a nuestro protocolo titulado "alimentador-cultura libre y pases de células iPS humanas con suero golpe de gracia completa sustitución del alimentador de medio libre"
Resultados esperados
Las células deben ser aproximadamente del 70-80% confluentes antes de la crioconservación. Dispasa resultados digestión en el curling y plegamiento de las colonias a lo largo de los márgenes de la colonia. Después de cosechar las células se congelan como pequeños grupos en los medios de criopreservación. Una vez que el vial se descongela, las células se recuperan y se unen al plato pre-recubiertos de pequeños grupos. Crecen rápidamente lleva a un plato de confluencia en 5-6 días.
Tabla 1 - Volúmenes recomendados
| Componente | 35 mm del plato | Plato de 60mm | Plato de 100 mm |
| Completa golpe de gracia SR medio | 2 mL | 4 ml | 10 ml |
| Geltrex Solución | 1 mL | 1,5 ml | 4.5 mL |
| Dispasa | 0,5 ml | 1 mL | 3.4 mL |
| D-PBS para enjuagar | 2 mL | 4 ml | 10 ml |
Por favor, haga clic aquí para ver el apéndice .
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM/F12 | 12660-012 | Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) | |
| KnockOut Serum Replacement | 10828-028 | ||
| KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail | A10580-01 | ||
| FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg | PHG0024 | Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes. | |
| 2-Mercapt–thanol | 21985-023 | ||
| Dispase | 17105-041 | Note: see appendix for alternative passaging methods | |
| Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL | A10480-01 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium | 14190-144 | ||
| DMSO, 500mL | JT Baker | JT9224-1 | |
| Sterile Tissue Culture Hood | |||
| Incubator set at 37°C | |||
| Pipette-Aid | |||
| Water Bath set at 37°C | |||
| Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL) | |||
| Centrifuge | |||
| 15 mL centrifuge tubes | |||
| 60 mm Tissue Culture treated dishes | |||
| Liquid nitrogen storage tank | |||
| Isopropanol freezing containers | |||
| 1.5 mL Cryovials |
References
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