Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

Summary

Peixe-zebra tem emergido como uma poderosa

Abstract

Dado o seu tamanho pequeno embrião, o rápido desenvolvimento, a transparência, a fecundidade, e numerosas semelhanças moleculares, morfológicas e fisiológicas para os mamíferos, peixe-zebra tem emergido como uma poderosa

Protocol

1) Coleta Egg Zebrafish

1. Na tarde anterior ao dia da tela químicos, criado 10-20 tanques de criação de peixe-zebra. Encher cada tanque com água do sistema de aquicultura. Usando uma rede de pesca, a transferência de um adulto do sexo masculino e 1-2 fêmeas adultas para recipiente interno em cada tanque de criação. Separar os peixes machos e fêmeas do outro com uma divisória. Rótulo as gaiolas e colocar uma tampa em cima deles.
2. Na manhã da tela, remover os divisores de tanques de criação e permitir zebrafish para acasalar. Ao longo de 1 hora seguinte, permitem ovos fertilizados para cair através de grade no fundo de cada recipiente interior.
3. Depois de uma hora, o retorno zebrafish adulto de volta para os tanques de armazenamento permanente, remova o recipiente interior e recolher os ovos por esforço da água em cada tanque de criação através de um coador de chá de plástico.
4. Inverter o filtro mais de uma placa de Petri e lavar o filtro com cuidado para lavar os ovos na placa de Petri, usando um frasco de lavagem contendo o meio E3.
5. Todos os ovos não fertilizados, que aparecem opaco, deve ser removido com uma pipeta de plástico descartáveis. Cada cruz de acasalamento deve render cerca de 200 embriões.

2) arraying embriões em placas de 96 poços

1. Transferência de cerca de 5 embriões em meio E3 em cada poço de uma placa de 96 poços usando um copo Pasteur pipeta.
2. Uma vez que os embriões são dispostos sobre a placa de 96 poços, remover o máximo do meio E3 possível fora dos poços usando um de 12 canais (3-30 mL) pipeta, tomando cuidado para não perfurar o embrião. Usando a pipeta de 12 canais, entregar 250 L de meio contendo canamicina E3 0.5μg/ml a cada poço o mais rapidamente possível de modo a não permitir que os embriões a secar.
3. Coloque as placas de 96 poços em 28,5 ° C incubadora até atingir o estágio desejado quando os compostos a serem adicionados.

3) Transferência da Biblioteca pequena molécula

Enquanto a transferência de composto pode ser automatizada com métodos de transferência de robótica, vamos descrever o método de transferência manual.

1. Bibliotecas de moléculas pequenas são normalmente fornecidos em um formato de 96 poços, com cada composto armazenados em DMSO como um estoque de 10 mm. Cerca de 60 minutos antes de os embriões atingem o estágio quando os compostos estão a ser adicionado, descongelar um número desejado de placas de 96 poços contendo alíquotas de pequenas moléculas (placa fonte). Tome nota do número de identificação de série ou outra das placas fonte. Para minimizar a condensação nas placas, o descongelamento pode ocorrer em uma câmara de dessecação contendo Drierite (WA HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
2. Brevemente girar os pratos em uma centrífuga de mesa equipados com multi-bem adaptador placa.
3. Remova a fita de vedação de alumínio da placa fonte. Com uma pipeta de 12 canais, diluir os compostos na placa fonte para a concentração de 0,5 mM (por exemplo, se iniciar com 250 nL alíquotas de estoque 10mM, adicionar 4,75 mL de DMSO a cada poço).
4. Quando os embriões na placa de 96 poços (placa destinatário) alcançar o estágio desejado, use uma de 12 canais (20-20 mL) pipeta para transferir 2.5μL de compostos (0,5 mm) das placas de origem para as placas contendo o destinatário embriões.
5. Registre o número de identificação das placas de fonte nas placas embrião destinatário. Cobrir as placas destinatário agora contendo os embriões e os compostos com tampas, misture delicadamente as placas rodando suavemente, e colocá-los em uma incubadora de 28,5 ° C.
6. Cubra cada prato de origem que contém pequenas moléculas não utilizados (0,5 mM), com uma fita de vedação de alumínio e coloque em um freezer -80 ° C para armazenamento de longo prazo.

4) Triagem para efeitos de pequenas moléculas por Inspeção Visual de fenótipos

1. Antes de executar a tela, formular um critério específico para o que constituiria um "hit".
2. Às vezes desejado em desenvolvimento, remover as placas de 96 poços contendo compostos tratados com embriões de incubadora e analisar cada um bem sob um estereomicroscópio. Para melhor visualização de mudanças sutis, tais como mudanças no padrão circulatório, um microscópio de contraste de fase invertido pode ser usado. Microscopia fluorescente pode ser usado para examinar perturbação da expressão de GFP ou proteínas DsRed sob um promotor de tecidos específicos.
3. Digitalizar rapidamente as placas de 96 poços para qualquer bem em que pelo menos 3 de 5 embriões apresentam o prescrito "hit" fenótipo. Registo da identidade da placa ea localização de cada bem hit em potencial.
4. Reconfirmar um hit em potencial por novos testes dos efeitos do composto em diversas doses (1 uM, 5 uM, 10 mM e 50 mM). Para cada dose, 10 embriões são testados em 0,5 mL de mídia E3 em um formato de placa 48 poços. O momento da adição de compostos de um novo ensaio deve ser idêntica à do exame original. Um hit é confirmado quando o fenótipo é reproduzido em provocou a reavaliação do compound
5. Identificar o composto hit do banco de dados de pequenas moléculas na biblioteca química.

Discussion

Ao planejar uma tela químicos baseados em zebrafish, atenção especial deve ser dada a robustez do fenótipo em questão e da taxa de fundo de fenótipo tal. Isto é particularmente importante para as telas de supressores químicos de um fenótipo induzido. Por exemplo, para um fenótipo causado por choque térmico a indução de um transgene, a condição que induz o fenótipo reproducibly deve ser precisamente traçada antes de iniciar a tela para evitar inaceitavelmente elevado as taxas de falsos positivos. Com um planejamento cuidadoso, telas zebrafish química, que exigem investimento de capital modesto, pode levar à descoberta de modulador da novela de sinalização celular e fisiologia, bem como composto de chumbo para reverter modelos de doenças humanas. Por fim, por analogia ao clássico frente telas genética, telas zebrafish baseado químicos podem ser valiosas para a indústria química análise genética de processo biológico fundamental.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number
Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
Petri dishes (10 cm).
Plastic tea strainer.
Wash bottle containg embryo water.
Disposable polyethylene transfer pipettes.
Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).