Leukotriene बी के वास्तविक समय इमेजिंग ₄ मध्यस्थता सेल प्रवासन और β-arrestin साथ BLT1 सहभागिता

Summary

इस कागज leukocytes के chemotactic विशिष्ट ligands के जवाब का निर्धारण और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स और साइटोसोलिक प्रोटीन जीना सेल इमेजिंग तकनीक का उपयोग के बीच बातचीत की पहचान करने की पद्धति का वर्णन करता है.

Protocol

क्रियाविधि

माइक्रोस्कोप विवरण

लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों ते एफएम महामारी प्रतिदीप्ति Nikon उल्टे माइक्रोस्कोप से जुड़ी TE300 ग्रहण प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया. खुर्दबीन हीटिंग मंच के साथ सुसज्जित है. एक शांत तस्वीर मुख्यालय डिजिटल बी / डब्ल्यू (नट वैज्ञानिक) सीसीडी कैमरा और LAMDA 10-2 ऑप्टिकल फिल्टर परिवर्तक (Sutter उपकरण कंपनी) खुर्दबीन से जुड़ा हुआ है. उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्य फिल्टर पहियों के साथ नियंत्रित कर रहे हैं और लांबा 10-2 फिल्टर पहिया नियंत्रक द्वारा नियंत्रित हैं, Sutter उपकरण कं एक्सपोज़र समय 500 एमएस जीवित कोशिकाओं में आरएफपी या GFP देखने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. हार्डवेयर नियंत्रण और छवियों के अधिग्रहण Metamorph सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. EGFP / DsRed दोहरी dichroic, Chroma प्रौद्योगिकी, वर्तमान अध्ययन के लिए फिल्टर का विकल्प, फिल्टर S480/20x S525/40m और S565/25x GFP और आरएफपी के लिए S620/60m, क्रमशः सेट. इस फिल्टर पहिया छह फ़िल्टर सेट करने के लिए समायोजित कर सकते हैं. माइक्रोस्कोप जोय छड़ी के साथ पिछले Proscan चरण नियंत्रक के साथ जुड़ा हुआ है. इन सभी हार्डवेयर संलग्नक Metamorph सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है है. माइक्रोस्कोप भी Micromanipulators साथ जुड़ा हुआ है micropipettes पकड़.

ए मापने leukotriene ₄ निर्देशित वृक्ष के समान सेल प्रवासन बी

ऊपर वर्णित खुर्दबीन सेटिंग का उपयोग करना, हम वास्तविक समय में ligand निर्देशित वृक्ष के समान सेल प्रवास के बाद के लिए तरीके विकसित किया है. दो micromanipulators (Narishige) खुर्दबीन से जुड़े होते हैं. माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न LTB ₄ ढाल की दिशा में वृक्ष के समान कोशिकाओं (BMDCs) के chemotaxis दर्ज की गई थी. यहाँ, हम सूक्ष्म pipettes तैयार सूक्ष्म विंदुक डांड़ी का उपयोग करने की विधियों का वर्णन, सूक्ष्म पिपेट में ligand लोड हो रहा है और कक्षों की दिशात्मक प्रवास की निगरानी करने के लिए माइक्रोस्कोप के गर्म मंच पर chemotaxis प्रयोग की स्थापना. इस विधि के लिए प्रवास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीवित कोशिकाओं में chemotaxis के inhibitors के प्रभाव उत्प्रेरण में अलग chemoattractants की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है. माउस से ²¹ BMDCs के अलगाव ²² जौव सहित कई प्रकाशनों में वर्णित किया गया है.

1. BMDCs की तैयारी

1. प्लेट कवर पर्ची नीचे Fluoro पकवान और उन्हें 16 घंटा के लिए प्रयोग के आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं पर BMDCs (10 दिनों के लिए संवर्धन के बाद).
2. 1X पीबीएस के 3 एमएल कम से कम 2 बार (थाली करने के लिए 1X पीबीएस के 3 एमएल जोड़ने और बफर बाहर aspirating) के साथ कोशिकाओं को धो लें.
3. थाली 1XPBS की 2 एमएल जोड़ें. कोशिकाओं को अब कर रहे हैं प्रयोग के लिए तैयार है. 37 में कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर प्रयोग करने से पहले रखें.

Ligand लोड माइक्रो पिपेट की तैयारी:

4. फिक्स ऊर्ध्वाधर micropipette डांड़ी (Narishige अंतर्राष्ट्रीय संयुक्त राज्य अमेरिका, Inc), गिलास केशिका ट्यूब (6 ", # बिल्ली 625500, एएम सिस्टम्स, कांग्रेस ग्लास मानक, 0.75 x 0.4 मिमी).
5. 52 में तापमान रखें ° सी कांच और पिघल और अलग खींच करने के लिए तेज धार युक्तियाँ के रूप में अनुमति है.
6. विंदुक सूक्ष्म विंदुक धारक पर तय करो.
7. M-900 खुर्दबीन के नीचे देख (Narishige अंतर्राष्ट्रीय संयुक्त राज्य अमेरिका, Inc) द्वारा सूक्ष्म विंदुक के किसी न किसी किनारों माइक्रो बनाने का उपयोग कर चिकना.
8. प्रत्येक प्रयोग के लिए कम से कम 10-20 pipettes तैयार. नोट: micropipettes विश्व परिशुद्धता उपकरण (μ टिप, T1801TW1F) से भी खरीदा जा सकता है है.
9. 1 एमएल effendorf ट्यूब में ligand के वांछित एकाग्रता (वर्तमान प्रयोग में 100 एनएम ₄ LTB 500 μL) ले लो और समाधान में माइक्रो विंदुक टिप रखने के लिए और समाधान सूक्ष्म विंदुक (वापस भरने) में प्रवेश करने की अनुमति .
10. Ligand और सिरिंज (1 सीसी tuberculin सिरिंज) में 1 एमएल ले लो और धीरे धीरे ligand सूक्ष्म पिपेट में ऊपर से माइक्रो भरण सुई (एमएफ 28G 5-, विश्व परिशुद्धता उपकरण) का उपयोग कर भरने के.
11. टयूबिंग, जो विंदुक कसकर फिट बैठता है विंदुक और ट्यूब के लिए सुई (21 जी 11 / 2) 1 एमएल सिरिंज, जो ligand से भर जाता है संलग्न करने के लिए संलग्न.
12. अब, ध्यान से खुर्दबीन मंच और तय करने के लिए माइक्रो manipulators पर सूक्ष्म विंदुक भरा ligand कदम.
13. लागू सिरिंज से थोड़ा दबाव बनाने के लिए यकीन है कि ligand टिप धीरे से जारी है.
14. खुर्दबीन से मढ़वाया अपरिपक्व BMDCs लाओ और उन्हें गर्म थाली (37 डिग्री सेल्सियस) चरण पर रख.
15. Fluoro डिश के ढक्कन निकालें.
16. तेल विसर्जन 60x उद्देश्य लेंस का उपयोग कोशिकाओं ध्यान दें.
17. ध्यान से, नीचे विंदुक लोड ligand कक्षों की निकटता के लिए 'मोटे मैनुअल MN-188NE मैनिप्युलेटर का उपयोग कर ले आओ.
18. विंदुक हाइड्रोलिक ठीक micromanipulator MN-188 पूर्वोत्तर 'का उपयोग ध्यान दें.
19. सिरिंज से थोड़ा दबाव लागू करने के लिए यकीन है कि ligand डिश में जारी है.
20. छवि अधिग्रहण पैरामीटर सेट में अधिग्रहण हर 15 सेकंड में उज्ज्वल (10 एमएस जोखिम) 2 Metamorph सॉफ्टवेयर का उपयोग बजे के लिए दायर की.
21. जनसंपर्क के लिए हर 30 मिनट की निगरानी रखेंligand की ओर पलायन के ogression.
22. यदि कोशिकाओं विंदुक टिप पर भीड़ कर रहे हैं, थाली में टिप का स्थान बदलने के प्रयोग के प्रवास को जारी रखने के लिए.

बी मापने (BLT1) GPCR और साइटोसोलिक (β-arrestin) प्रोटीन सहभागिता, लाइव कक्ष में स्थानान्तरण

1. प्लास्मिड डीएनए constructs की तैयारी

डीएनए प्लाज्मिड constructs के विवरण जला एट अल. (2005) ¹⁸ में वर्णित किया गया.

2. मानव BLT1 आरएफपी और β-Arrestin - GFP RBL 2H3 कक्ष में अभिकर्मक

1. चूहा Basophilic (RBL 2H3) Leukomia 37 पर (60 से 70% संगम) कक्ष ° 95% हवा की humidified वातावरण में सी, 5% सीओ ₂ रखें वृद्धि मीडिया में monolayer संस्कृतियों (DMEM 15% FBS, 2 के साथ पूरक के रूप में एल glutamine मिमी, 100 U / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / एमएल) T75 बोतल में स्ट्रेप्टोमाइसिन.
2. Trypsin - EDTA के 6 एमएल (0.05% trypsin, 0.53 मिमी EDTA) का उपयोग और 37 पर 5 मिनट के लिए incubating द्वारा पकवान / बोतल से कोशिकाओं को अलग ° 95% हवा की humidified वातावरण में सी, _5% सीओ 2. धीरे बोतल हिला कोशिकाओं की टुकड़ी की हद पर नजर रखने के.
3. Trypsin EDTA के 6 एमएल युक्त कुप्पी के लिए विकास मीडिया के 6 एमएल जोड़ें और उन्हें ऊपर और नीचे pipetting कई बार मिश्रण से कोशिकाओं को इकट्ठा. 15 एमएल बाज़ ट्यूबों में कोशिकाओं का स्थानांतरण.
4. Hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती और 15 एमएल अपकेंद्रित्र और ट्यूबों 3 और अभिकर्मक मीडिया के 200 μL में मिनट resuspend के लिए 480g rpm (DMEM, 20% FBS, 50 मिमी HEPES) अपकेंद्रित्र में 4 x ¹⁰ 6 कोशिकाओं ले . यदि आप 3 transfections प्रदर्शन की योजना है, कोशिकाओं और tranfection मीडिया सेल नंबर बढ़ाने और अभिकर्मक मध्यम मात्रा द्वारा तदनुसार तैयार.
5. के लिए कम से कम 1.5 / μg μL के सांद्रता में ट्रांसफ़ेक्ट हो plasmids तैयार करें. हम QIAGEN मैक्सी डीएनए प्लाज्मिड किट का उपयोग करके डीएनए प्लाज्मिड तैयार करते हैं. बाँझ वैद्युतकणसंचलन cuvettes (जैव - रेड # 16,552,088) है, जो 0.4 सेमी इलेक्ट्रोड अंतराल है व्यक्तिगत या मानव BLT1 (25 μg) - आरएफपी और बीटा arrestin1-GFP (15 μg) के लिए दोनों प्लाज्मिड DNAs एन्कोडिंग जोड़ें.
6. ऊपर resuspended कोशिकाओं के 200 μL ले लो और उन्हें या तो hBLT1 - आरएफपी या β-arrestin1-GFP या दोनों एक साथ युक्त cuvettes में जगह है और उन्हें 1 एमएल बाँझ विंदुक के साथ धीरे मिश्रण.
7. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊपर cuvettes छोड़ो.
8. जीन Pulser द्वितीय में वोल्टेज 250 v और क्षमता 500 μF के साथ कोशिकाओं Electroporate.
9. Electroporation बाद कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रहने.
10. नियमित रूप से मध्यम विकास के 1 एमएल ले लो और यह cuvettes में electroporated कोशिकाओं के साथ मिश्रण.
11. 35 मिमी ऊतक गिलास नीचे संस्कृति (Fluoro पकवान, विश्व प्रेसिजन उपकरण) व्यंजन नियमित रूप से विकास मीडिया की 2 एमएल युक्त में इस मिश्रण के 300 μL वितरित और 37 में 1 घंटे के लिए सेते ° C 95% हवा की humidified माहौल में, 5% सीओ _2. कोशिकाओं पकवान के नीचे का पालन करने की अनुमति दें.
12. नियमित रूप से विकास मीडिया के साथ 1 घंटे ऊष्मायन के बाद मीडिया को बदलें और उन्हें 37 से बढ़ने की अनुमति ° 95% हवा की humidified वातावरण में सी, _5% 18-24 बजे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर.

3. लाइव सेल इमेजिंग

छवियों का अधिग्रहण

1. 18-24 बजे के बाद, गर्म phenol लाल मुक्त RPMI 2 एमएल 10 मिमी HEPES, पीएच 7.55 (गर्म मीडिया की 2 एमएल सीधे प्लेट और aspirate मीडिया 2 दोहराएँ या 3 बार जोड़ें.) युक्त के साथ 2 कोशिकाओं या 3 बार धो लो. गर्म phenol लाल मुक्त RPMI 1.8 एमएल 10 मिमी HEPES युक्त जोड़ें.
2. प्लेस 30 मिमी कांच coverslip तली संस्कृति RBL 2H3 कोशिकाओं, hBLT1 आरएफपी और गरम खुर्दबीन मंच पर β arrestin1-GFP (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट युक्त व्यंजन.
3. 600x बढ़ाई 60 एक्स उद्देश्य Nikon ए पी ओ 60X/1.4 संख्यात्मक एपर्चर तेल विसर्जन लेंस (हमारे खुर्दबीन प्रणाली में उपलब्ध) योजना का उपयोग कर सेल छवियों लीजिए.
4. X 60 उद्देश्य lense पर एक तेल बूंद रखो और नियमित रूप से उज्ज्वल क्षेत्र के साथ कोशिकाओं ध्यान केंद्रित प्लेट के नीचे छू द्वारा प्रकाश फैलता है.
5. ट्रांसफ़ेक्ट प्रोटीन के प्रतिदीप्ति, उज्ज्वल क्षेत्र (प्रेषित प्रकाश) से प्रतिदीप्ति फिल्टर (आरएफपी फिल्टर, अगर आप रिसेप्टर या GFP देखने के लिए, यदि आप बीटा arrestin1 देखना चाहता हूँ चाहते हैं) करने के लिए स्विच की निगरानी करने के लिए.
6. उज्ज्वल और स्वस्थ कोशिका है, जो सेल आरएफपी फिल्टर और छवि पर कब्जा का उपयोग कर सतह पर hBLT1 - आरएफपी व्यक्त चुनें.
7. फिर GFP फिल्टर करने के लिए पाली और सुनिश्चित करें कि बीटा arrestin-GFP cytoplasm में व्यक्त करने और छवि पर कब्जा. फिर छद्म रंग दोनों छवियों पर कब्जा समय से पहले रहते सेल छवियों व्यपगत को यकीन है कि प्रतिदीप्ति के माध्यम खून आरएफपी और GFP के बीच होने वाली नहीं ले रही है.
8. एक बार अपने सेल का चुनाव किया है, सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अपने उद्देश्य (इस उदाहरण में Metamorph सॉफ्टवेयर) के अनुसार मानकों सेट.
9. वर्तमान प्रदर्शन में, सोलह बिट छवियों को आया के साथ प्राप्त कर रहे हैंआर ए binning 1 पर सेट एक्स 60 एक्स उद्देश्य Nikon योजना ए पी ओ 60X/1.4 संख्यात्मक एपर्चर तेल विसर्जन लेंस के साथ संयुक्त 1.
10. इन का उपयोग कर फ़िल्टर Metamorph सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित पहियों के 30 सेकंड समय अंतराल (अगर / स्थानान्तरण बातचीत बहुत तेजी से कर रहे हैं, एक समय अंतराल को कम कर सकते हैं) पर आरएफपी और GFP fluorochromes को एक साथ के लिए छवियों प्रतिदीप्ति लीजिए.
11. कैमरा जोखिम बार आरएफपी और GFP के लिए 1000 मिसे के लिए सेट. (आरएफपी और GFP की फ्लोरोसेंट तीव्रता के अनुसार विशिष्ट जोखिम बार सेट).
12. पहले जोड़ने ligand, जो 0 समय बिंदु के रूप में कार्य करता है के बिना 1 मिनट के लिए छवियों को इकट्ठा.
13. Ligand के 200 μL (10 सुक्ष्ममापी के स्टॉक से 1 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता) प्लेट / या सेल की स्थिति को परेशान बिना 1 मिनट के बाद जोड़ें.
14. प्रतिदीप्ति छवियों ligand जोड़ने के बाद 60 मिनट के लिए एकत्र होते हैं और फ़ाइल नाम के बढते क्रम के साथ झगड़ा छवियों के रूप में संग्रहीत.
15. इन सभी फ़ाइलों को समय टिकटों का उपयोग सॉफ्टवेयर के साथ व्यक्तिगत / संयुक्त प्रतिदीप्ति छवियों के साथ ढेर फ़ाइलों के रूप में बनाया जा सकता है है.

छवियों के प्रक्रिया और प्रोटीन और स्थानीयकरण के प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव

1. आरएफपी और GFP फ्लोरोसेंट फिल्टर के साथ सादे मीडिया (कोई कोशिकाओं) के साथ छवियों को मोल और पृष्ठभूमि छवियों के रूप में उन्हें बचाने. इन छवियों का उपयोग करने के लिए वास्तविक डेटा ऊपर प्राप्त छवियों से घटाना.
2. आरएफपी और GFP छवियों के लिए छवियों के ढेर अलग - अलग तैयार.
3. का चयन करें / विभिन्न क्षेत्रों (सतह बनाम साइटोसोलिक) आरएफपी और GFP की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने (BLT1 β-arrestin स्थानान्तरण) परिभाषित
4. समय के समारोह के रूप में राशि प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लॉट. यह ग्राफ दिया अणु के स्थानान्तरण के कैनेटीक्स के बारे में जानकारी प्रदान करेगा.

प्रतिनिधि परिणाम

ए मापने leukotriene 4 निर्देशित वृक्ष के समान सेल प्रवासन _बी

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि leukotriene ₄ बी (चित्रा 1 और संलग्न वीडियो 1) ²¹ की ओर वृक्ष के समान सेल प्रवास का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हम इसी तरह की पद्धति लागू करने के लिए जीवित कोशिकाओं में एक विशेष ligand करने के लिए कक्षों की chemotactic क्षमता का निर्धारण कर सकते हैं.

चित्रा माउस 1. अस्थि मज्जा 100 ₄ LTB एनएम की दिशा में वृक्ष के समान सेल प्रवास निकाली गई.

वीडियो 1. ₄ LTB की ओर BMDCs के सेल प्रवास लाइव वीडियो को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

बी मापने (BLT1) GPCR और साइटोसोलिक (β-arrestin) प्रोटीन सहभागिता, लाइव कक्ष में स्थानान्तरण

इस प्रक्रिया के पूरा होने पर, एक GPCR संकेत घटनाओं में निम्नलिखित जानकारी प्राप्त कर सकते हैं.

1. GPCR और साइटोसोलिक प्रोटीन और नाभिक के स्थानीयकरण (चित्रा 2).
2. Ligand साइटोसोलिक प्रोटीन (इस मामले में β-arrestin) (चित्र 3) के साथ सतह GPCR (BLT1 इस मामले में) के प्रेरित बातचीत.
3. रिसेप्टर internalization और झिल्ली को β-arrestin स्थानान्तरण के कैनेटीक्स रिसेप्टर्स (चित्रा 4) ¹⁸ (2005 जला एट अल.) के साथ internalization द्वारा पीछा किया.
4. एक ligand जीवित कोशिकाओं में निर्भर रिसेप्टर सक्रियण स्थिति (2 वीडियो संलग्न) का निर्धारण और महत्वपूर्ण रूपांकनों या रिसेप्टर (2005 जला एट अल.) सक्रियण ¹⁸ में शामिल प्रक्रियाओं को निर्धारित कर सकते हैं .

चित्रा 2 BLT1 - आरएफपी (ए), बीटा arrestin-GFP (बी), pNuc CFP (सी) के RBL 2H3 कोशिकाओं में अभिव्यक्ति. रंग संयुक्त पैनल डी. में दिखाया छवि

चित्रा 3 ligand रिसेप्टर और β-arrestin प्रेरित स्थानान्तरण. कोशिकाओं में तीव्रता के फ्लोरोसेंट रेखा स्कैन से पता चला रहे हैं.

चित्रा 4 1 ₄ LTB सुक्ष्ममापी के अलावा पर ​​रिसेप्टर internalization और β-arrestin स्थानान्तरण के कैनेटीक्स. प्रतिदीप्ति तीव्रता झिल्ली और सेल के साइटोसोलिक स्थानों पर समय के एक समारोह के रूप में मापा गया.

वीडियो 2 1 सुक्ष्ममापी ₄ LTB के अलावा पर ​​BLT1 आरएफपी और बीटा arrestin-GFP व्यक्त कोशिकाओं के लाइव इमेजिंग. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के

Discussion

लाइव सेल इमेजिंग समारोह और विशिष्ट प्रोटीन की बातचीत के रूप में वे वास्तविक समय में होते हैं प्रदर्शित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. इस पांडुलिपि में वर्णित विधियों को स्पष्ट रूप से _{दिखाने} के लिए है कि LTB 4 वृक्ष के समान कोशिकाओं का तेजी से प्रवास प्रेरित कर सकते हैं. इन तरीकों में न केवल LTB ₄ विविध प्रकार की कोशिकाओं के समारोह के पहलुओं का विस्तार, वे इसी तरह के तरीकों के अन्य chemokines की एक किस्म के लिए लागू किया जा करने के लिए और अलग ल्युकोसैट उप आबादी पर chemotactic एजेंट के रूप में उनकी प्रभावकारिता परीक्षण की अनुमति देते हैं. इस प्रणाली में प्रतिदीप्ति इमेजिंग वास्तविक समय में संकेत घटनाओं की निगरानी के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, इन तरीकों में भी vivo में प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) उपयुक्त टैग अणुओं flurochromes का उपयोग निम्नलिखित के द्वारा अणुओं की तंग सहयोग की जांच बढ़ाया जा सकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.	ATCC	CRL-2256
Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen	11995
Phenol red free RPMI or DMEM	Invitrogen	11835-030
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030
Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)	Invitrogen	15140
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25300
HEPES (1M)	Invitrogen	15630
35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)	Bio-Rad	16552088
Gene Pulser II electroporater	Bio-Rad
TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300	Nikon Instruments
Metamorph Software	Universal Imaging
Vertical Micro-pipette puller	Narishige International
Micro-Forge M-900	Narishige International
Hadraulic Micromanipulator MO-188NE	Narishige International
Coarse Manual Manipulator, MN-188NE	Narishige International
cDNA constructs:
cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)	Jala et al 2005
cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study).	Jala et al 2005