Summary
قمنا بتصميم تجربة خالية من الخلايا مستقبلات ملزمة من أجل تقدير الربط عامل تحفيز مستعمرة محببة - البلاعم (GM - CSF) إلى المستقبلات. انها تمكننا من تقييم التثبيط التنافسي للbiotinylated GM - CSF ملزم لمستقبلات ألفا للذوبان GM - CSF - CSF من قبل جنرال موتورز مع الأجسام المضادة استنساخ ممتازة.
Abstract
الخلفيات : في السابق ، ونحن أثبتت أن القدرة على تحييد لكنه لا يرتبط تركيز الأجسام المضادة GM - CSF مع شدة المرض في المرضى الذين يعانون من المناعة الذاتية البروتيني السنخي الرئوي (PAP) 1-3. وإلغاء النشاط الحيوي GM - CSF في الرئة هو السبب المرجح لPAP 4،5 المناعة الذاتية ، فهو يبشر بالخير لقياس قدرة جنرال موتورز تحييد الأجسام المضادة - CSF لتقييم شدة المرض في كل مريض مع PAP.
حتى الآن ، وقد تم تقييم قدرة جنرال موتورز تحييد الأجسام المضادة - CSF من خلال تقييم تثبيط نمو خلايا نخاع العظام أو خلايا TF - 1 حفز مع GM - CSF 6-8. في النظام الأحيائي ، ومع ذلك ، غالبا ما يكون مشكلة للحصول على بيانات موثوق بها وكذلك للمقارنة بين البيانات المأخوذة من مختلف المختبرات ، وذلك بسبب الصعوبات التقنية في الحفاظ على الخلايا في حالة ثابتة.
الهدف : محاكاة GM - CSF ملزم لمستقبلات GM - CSF على سطح الخلية باستخدام خالية من الخلايا مستقبلات ملزمة مقايسة.
تم تطبيق تكنولوجيا المعدلة وراثيا دودة القز من أجل الحصول على مبلغ كبير بالنسبة لالمؤتلف مستقبلات ألفا للذوبان GM - CSF (sGMRα) مع درجة نقاوة عالية 9-13 : طرق. وكان يرد sGMRα المؤتلف في الطبقات المائية سيريسين من الخيوط الحريرية دون تنصهر للبروتينات الحرير ، وبالتالي ، يمكننا بسهولة استخراج من الشرانق في الطهارة جيدة مع المحاليل المائية المحايدة 14،15. لحسن الحظ ، فإن الهياكل oligosaccharide ، التي هي حيوية للربط مع GM - CSF ، أكثر مشابهة للهياكل sGMRα الإنسان من تلك التي تنتجها الحشرات الأخرى أو الخمائر.
النتائج : نظام مقايسة خالية من الخلايا باستخدام sGMRα أسفرت البيانات مع مرونة وموثوقية عالية. وكان GM - CSF ملزمة لsGMRα الجرعة بشكل تابع تثبطها الأجسام المضادة GM - CSF النسائل المتعددة بطريقة مشابهة لما الأحيائي باستخدام الخلايا TF - 1 ، مشيرا إلى أن لدينا نظام جديد خالية من الخلايا باستخدام مقايسة sGMRα هو أكثر فائدة لقياس النشاط تحييد GM - CSF من الأجسام المضادة من النظام الأحيائي باستخدام TF - 1 خلية أو خلايا نخاع العظام.
الاستنتاجات : نحن إنشاء مقايسة خالية من الخلايا قياس قدرة جنرال موتورز تحييد الأجسام المضادة - CSF.
Protocol
1. إنتاج وتنقية sGMRα
- [كدنا] تضخيم من sGMRα من المشيمة البشرية [كدنا] مكتبة عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).
- إضافة قاعدة 5' - 50 UTR تسلسل نهاية polyhedrin الفيروسة العصوية وRGS قاعدة 27 - الترميز صاحب العلامة لانهاء 3 'إلى آخر amplicon PCR PCR.
- إدراج منتج PCR تضخيمها الى pMSG1.1MG البلازميد.
- حقن psGMR/M1.1MG بناء ناقلات مع مساعد pHA3PIG في بويضات من سلالة PND - W1 دودة القز.
- مؤخرة تحاك ليرقات العث G0 عند 25 درجة مئوية. أجنة G1 الشاشة التي حصلت عليها التزاوج بين الأشقاء أو مع PND - W1 للتعبير MGFP في أعين المعدلة وراثيا للحصول على دودة القز التي تحمل الجينات sGMRα.
- استخراج المؤتلف sGMRα من شرانق دود القز وراثيا للفوسفات مع العازلة التي تحتوي على كلوريد الصوديوم ويقلب 500mM عند 4 درجات مئوية عن 24H.
- أجهزة الطرد المركزي في عينة ز 20000 ل15min لإزالة رواسب.
- تطبيق طاف إلى عمود النيكل تقارب.
- غسل العمود مع إيميدازول 10MM ، كلوريد الصوديوم 500mM و 20mm فوسفات الصوديوم ، pH6.3 ، وأزل مع التدرج الخطي للإيميدازول من 10mm إلى 250mM. تجمع الكسور التي تحتوي على sGMRα المنقى وdialyze ضد الفوسفات مخزنة المالحة (pH7.4) (PBS).
2. Biotinylation من المؤتلف GM - CSF
- إزالة إعداد السوربيتول ضد غسيل الكلى عن طريق برنامج تلفزيوني.
- إضافة 1ml من 20mM الباردة حل التلوي بريودات الصوديوم عند 4 درجة مئوية إلى الحل على الجليد.
- نموذج لاحتضان 30min على الجليد في الظلام.
- إضافة الجلسرين إلى الحل في التركيز النهائي لل15mM.
- Dialyze الحل ضد 100mM خلات الصوديوم العازلة (pH5.5)
- إضافة البيوتين هيدرازيد إلى الحل في التركيز النهائي لل5mM وتحرض باستمرار على حل ل2H في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المواد غير رد فعل من قبل غسيل الكلى ضد برنامج تلفزيوني ، pH7.4.
3. خلية خالية GM - CSF مستقبلات يجند ملزم مقايسة
- معطف لوحة microtiter مع 50μl من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للpolyHistidine بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تغسل خمس مرات مع 500μl من PBST.
- إضافة 100μl حل الحجب واحتضان ل3H في 4 درجات مئوية.
- تغسل خمس مرات مع 500μl من PBST.
- إضافة 50μl من sGMRα في حل الحجب واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تغسل خمس مرات مع 500μl من PBST.
- إضافة 25μl من العينات تحتوي على GM - CSF الأجسام المضادة ثم 25μl من biotinylated GM - CSF. لاحتضان 1H في 4 درجات مئوية لتشكيل sGMRα - GM - CSF المعقدة.
- تغسل خمس مرات مع 500μl من PBST.
- إضافة 50μl من الفوسفاتيز القلوية streptavidin 0.4mM ل1hour في 4 درجات مئوية للكشف عن biotinylated GM - CSF sGMRα ملزمة.
- تغسل خمس مرات مع 500μl من PBST.
- إضافة 50μl من ركيزة chemiluminescent إلى الحل والمحتضنة ل1H في درجة حرارة الغرفة.
- لمعان كيميائي باستخدام قارئ لوحة ، وكشف عن نشاط لمعان كيميائي.
4. ممثل النتائج :
الخطوة الأولى في مسار مستقبلات GM - CSF نقل الإشارة هو ملزم GM - CSF لمستقبلات ألفا GM - CSF على سطح الخلية. لأن الأجسام المضادة GM - CSF تربط تحديدا GM - CSF وكتلة ملزم لمستقبلات 16،17 في المختبر ، ونحن افترضنا أن هذه الأجسام المضادة تمنع أول رد فعل من قبل ملزمة مباشرة إلى GM - CSF. كما هو موضح سابقا (المرجع 9-15) ، طبقنا المعدلة وراثيا دودة القز التكنولوجيا للحصول على كمية كبيرة من sGMRα المؤتلف مع درجة نقاوة عالية.
وأظهرت sGMRα عندما تم تحميل دودة القز المستمدة sGMRα المؤتلف على SDS - PAGE تحت ظروف غير الحد ، سواء موحودي (45 كيلو دالتون) ومثنوي (90 كيلو دالتون) الأشكال ، في حين تم الكشف عن النموذج الوحيد في ظل ظروف موحودي الحد (1B الشكل) ، مشيرا الى ان sGMRα المؤتلف وكان مزيجا من مونومرات وثاني كبريتيد مرتبطة المخفتات 18.
باستخدام نظام خالية من الخلايا (الشكل 2A) ، ونحن قيمت تثبيط GM - CSF ملزمة لsGMRα من قبل جنرال موتورز - CSF الأجسام المضادة (الشكل 2B 2C والشكل). وقد وصفت هذه الأساليب في اشارة بواسطة أورانو 19 آخرون. وترتبط بشكل وثيق مع تثبيط نمو تثبيط ملزم (ص = 0.988 ، P = 0.002) بتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة GM - CSF (الشكل 3A) 19. وبالمثل ، فقد ارتبط بشكل ملحوظ تثبيط ملزم مع تثبيط النمو. وتثبيط ملزم زادت بطريقة تعتمد على الجرعة التي كتبها GM - CSF الأجسام المضادة (الشكل 3B) 19. هذه كانت مرتبطة المعلمتين عن كسور مفتش المصل من المرضى المختلفة بعضها البعض (ص = 0.589 ع = 0.006 ، الشكل 3C). لا تثبيط ملزم ولا تثبيط النمو يرتبط بقيم دينار كويتي ، وبالتالي كل من المعلمات لم تتأثر ملزمة تقارب 19. استنساخ بالتالي ملزمة للبيانات بين وزوقد تم تقييم الحصول عليها عن طريق تثبيط rowth ثلاث تجارب مستقلة على ثلاث عينات مختلفة. وأشار إلى أن معامل الاختلاف في منظومة خالية من الخلايا كان أكثر من ممتازة من ذلك الأحيائي (الجدول 1).
الشكل 1. مخطط تدفق الإجراء لإنتاج المعدلة وراثيا باستخدام sGMRα دودة القز. أ) هياكل ناقلات التحول 9-11. B) SDS - PAGE وCoomassie بريليانت الأزرق تلطيخ لتنقية sGMRα تحت تخفيض والحد من ظروف عدم. sGMRα ، قابل للذوبان GM - CSF مستقبلات ألفا ؛ MGFP ، بروتين فلوري الوحش الأخضر ؛ BmNPVpol5' - UTR ، 5' - تسلسل غير مترجمة المنطقة من الأسلحة النووية Bombyx موري polyhedrin فيروس polyhedrosis ؛ SV40 polyA ، SV40 تسلسل إشارة polyA ؛ ف 3xP3 ، 3xP3 المروج ؛ P ser1 ، ser1 المروج ؛ fibL polyA ، فبروين إشارة polyA L - سلسلة تسلسل ؛ hr3 ، Bombyx موري فيروس polyhedrosis النووية hr3 محسن.
الشكل 2. مخطط للنظام مقايسة خالية من الخلايا. أ) مقايسة تنافسية ملزمة باستخدام sGMRα التي تنتجها دودة القز. ب) تأثير تحييد الأجسام المضادة لإبطال مفعولها وغير على تثبيط ملزمة خالية من الخلايا النظام. C) والفرق بين من تثبيط ملزم تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة والأجسام المضادة غير لإبطال مفعولها. GM - CSF ، محببة ، بلعم مستعمرة عامل تحفيز ؛ ، قابل للذوبان sGMRα GM - CSF مستقبلات ألفا ؛ بلده ، RGS - - صاحب العلامة ؛ أ ب ، و الفوسفاتيز القلوية.
الشكل 3. GM - CSF ملزمة لتثبيط تأثير sGMRα بواسطة GM - CSF النسائل المتعددة أو الأجسام المضادة في مصل الدم كسور مفتش من المرضى الذين يعانون من PAP الذاتية. أ) العلاقة بين تثبيط ملزمة وتثبيط النمو GM - CSF الأجسام المضادة. B) تثبيط ملزم بتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة GM - CSF. ج) العلاقة بين IC 50 في المئة لتثبيط ملزمة وتثبيط النمو في المئة من الكسور مفتش المصل 19. IC 50 ، 50 ٪ تركيز المثبطة ؛ GM - CSF ، محببة ، بلعم مستعمرة عامل تحفيز.
| عينة | A | B | C |
| بين مقايسة | |||
| # من القرارات | 3 | 3 | 3 |
| يعني القيمة (٪ تثبيط ملزم) | 61.6 | 63.8 | 69.7 |
| يعني القيمة (٪ تثبيط النمو) | 21.0 | 73.4 | 82.8 |
| معامل الاختلاف (٪) (٪ تثبيط ملزم) | 6.0 | 5.6 | 8.3 |
| معامل الاختلاف (٪) (٪ تثبيط النمو) | 64.4 | 18.3 | 10.4 |
وأجريت فحوصات على حد سواء في 5 نانوغرام / مل من جنرال موتورز - CSF وتركيز يساوي GM - CSF الأجسام المضادة.
الجدول 1. مقارنة الاختلافات بين معامل ملزم في المئة ونمو الموانع الحصول عليها من خلال ثلاث تجارب مستقلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدرت مقايسة خالية من الخلايا تحييد قدرة جنرال موتورز - CSF الأجسام المضادة مع استنساخ ممتازة وسرعة. تم تقييم تثبيط ملزم من قبل جنرال موتورز - CSF الأجسام المضادة أو المريض المصل الكسور مفتش بواسطة هذا الاختبار. وأظهرت البيانات وجود ارتباط بين تثبيط ملزم للمقايسة خالية من الخلايا وتثبيط نمو الأحيائي باستخدام الخلايا TF - 1 على التوالي. كانت تستخدم على نطاق واسع الأحيائي ، ولكن آوى صعوبات في مقارنة البيانات بين المرافق المختلفة ونقاط زمنية مختلفة ، الأمر الذي يمكننا تجنب باستخدام هذا النظام الجديد.
GM - CSF بربط sGMRα مع تقارب المنخفضة ، وتشكل 20 الثنائية المعقدة. الدراسات الحديثة أثبتت أن الإنسان GM - CSF يربط مستقبلات ألفا GM - CSF وGM - CSF مستقبلات بيتا تشكيل مجمع dodecameric مع تقارب عالية على سطح الخلية 21. وبالتالي ، فإن نظام مقايسة على أساس ثلاثي يتألف من مجمعات مستقبلات GM - CSF موحودي ألفا وبيتا مثنوي مستقبلات GM - CSF يكون مرشح النظام في المستقبل لتحسين تجربة خالية من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نحن ممتنون جدا لNakagaki K. ، الدكتور إيشي H. ، الدكتور سوزوكي K. ، ياماغاتا A. ، K. Oofusa لما قدموه من مساهمات قيمة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
References
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
