A Matrigel basado en tubo de ensayo de formación para evaluar la actividad de las células tumorales vasculogénica

Summary

Un ensayo de la formación del tubo se utiliza para evaluar la actividad vascular de las células tumorales.

Abstract

Durante las últimas décadas, un ensayo de la formación del tubo con el factor de crecimiento reducido Matrigel ha sido generalmente empleado para demostrar la actividad angiogénica de las células endoteliales vasculares in vitro ^1-5. Sin embargo, evidencia reciente ha demostrado cada vez que este ensayo no se limita a probar el comportamiento de las células endoteliales vasculares. Por el contrario, también se ha utilizado para poner a prueba la capacidad de un número de células tumorales a desarrollar un fenotipo vascular ^6-8. Esta capacidad fue consistente con su comportamiento vasculogénica identificado en animales xenotransplantado, un proceso conocido como vasculogénica mímica (VM) ^9. Hay una gran cantidad de evidencias que demuestran que las células tumorales mediada por VM juega un papel vital en el desarrollo del tumor, con independencia de la angiogénesis de las células endoteliales ^{6, 10-13.} Por ejemplo, las células tumorales se encuentran para participar en la sangre perfunde la formación, el canal vascular en muestras de tejido de pacientes con melanoma y glioblastoma ^{8, 10, 11.} En este sentido, este ensayo se describe la red tubular como una herramienta útil en la evaluación de la actividad vasculogénica de las células tumorales. Hemos encontrado que algunas líneas celulares tumorales como el melanoma B16F1 células, las células de glioblastoma U87, y el cáncer de mama MDA-MB-435 células son capaces de formar túbulos vasculares, pero algunos no lo hacen, como el cáncer de colon HCT116 células. Además, este fenotipo vascular depende de el número de células chapada en el Matrigel. Por lo tanto, este ensayo puede servir de gran utilidad para detectar el potencial vascular de una variedad de tipos de células incluyendo las células vasculares, las células tumorales, así como otras células.

Protocol

1. A Matrigel basado en tubo de ensayo de formación para evaluar la actividad de las células tumorales vasculogénica

1. Preparación de las células tumorales y las células endoteliales microvasculares: las células de tumores cerebrales, tales como U87 células, las células del melanoma B16F1, el cáncer de mama MDA-MB-435, y las células del colon HCT116 fueron cultivadas en DMEM suplementado con FBS al 10% y penicilina / estreptomicina (todos de Invitrogen ). Línea de células endoteliales humanas células endoteliales microvasculares (HMVECs) se cultivaron en medio EBM2 (Lonza), complementado con 1 mg / ml de hidrocortisona y 1 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico, el 10% de SFB y penicilina / estreptomicina. Las células fueron lavadas tres veces con PBS y distante con el 0,05% de tripsina / EDTA (Invitrogen). Después de la centrifugación a 2.000 rpm durante 5 min, gránulos de las células se lavaron de nuevo con PBS. Luego, las células sedimentadas se contó con un hemocitómetro.
2. Preparación Matrigel: una alícuota de factor de crecimiento reducido Matrigel (BD Bioscience) se calentó a temperatura ambiente. Antes de que se están descongelando, fue trasladado en hielo y el líquido se mantuvo en hielo durante al menos 10 min. De 50 l de Matrigel se sembró a 96 y placas a un nivel horizontal que permite que el Matrigel para distribuir uniformemente, y se incubó durante 30 min a 37 ° C.
3. La formación del tubo: las células (1-2 x 10 ⁴⁾ se volvió a suspender con suero libre de DMEM para las células tumorales o EBM-2 para las células endoteliales, y se carga en la parte superior de la Matrigel. Si este ensayo se utilizó para medir los efectos de algunos agentes en el desarrollo de los túbulos, estos agentes (estimuladores o inhibidores) se añadieron al medio libre de suero. Cada grupo condicional contenida 4-6 pozos.
4. Imagen y análisis de datos: Después de la incubación a 37 ° C durante la noche, cada uno así se analizan directamente bajo un microscopio. Si los túbulos se necesitaban para la fijación, 100 l de formalina salina al 10% basado en solución se añadió con suavidad y diez minutos más tarde, estaba listo para su análisis. Bajo un microscopio con contraste de fase 10x, los túbulos en cada campo fueron fotografiadas y un promedio de túbulos 3-5 campos al azar en cada pozo se había contado.

2. Los resultados representativos:

HMVECs se utilizaron como control positivo, ya que estos tubos se desarrollaron a partir clara cuerpos celulares alargados que conectan a la red de forma poligonal. Células B16F1, U87, y MDA-MB-435 desarrollado túbulos vasculares similares a las formadas por HMVECs, pero HCT116 células no (Figura 1). Una célula dependiente de la dosis la formación del tubo se ha probado en células U87. Como se demuestra en la figura 2, 10000 células formadas túbulos interrumpido. Una vez que las células se duplicó, de una red vascular sólido es comparable a los observados en HMVECs. En contraste, las células de menos de 5.000 no lograron formar un fenotipo vascular.

Figura 1. Formación del tubo inducida por HMVECs, U87, MDA-MB-435, y las células B16F1, pero no las células HCT116. Todas las células (2 x 10 ⁴⁾ fueron cargados en Matrigel y se incubaron durante la noche. Túbulos estaban utilizando imágenes de contraste de fase. HMVECs se utilizaron como control positivo. Un representante de 3-5 campos se muestran. Bar: 100 micras.

Figura 2. U87 celular inducida por los túbulos, en un número de celular dependiente de forma. Diferentes números de células U87 como se indica en las esquinas se utilizan para la formación del tubo. HMVECs fueron utilizados para un control positivo. Bar: 100 mm.

Discussion

A fin de que este ensayo tenga éxito, la calidad de Matrigel debe ser probado por primera vez. Una pequeña muestra se puede obtener de BD Bioscience de pre-ejecución del ensayo utilizando HMVECs. Diferentes productos por lotes puede mostrar cualidades diferentes en los que algunos lotes no ofrecen condiciones óptimas para la formación del tubo. En segundo lugar, las burbujas deben ser evitados cuando una parte alícuota de Matrigel se carga en placas de 96 pozos, porque las burbujas pueden alterar la formación de túbulos. Si las burbujas pequeñas se encuentran en un pozo, el Matrigel puede ser de inmediato se trasladó de nuevo a los tubos de Matrigel original que se debe mantener en hielo durante el experimento. Además, las células prueba debe mantenerse en una tasa de crecimiento en una fase de registro. Cuando las condiciones cultivadas indicando un crecimiento lento de las células se producen, deben ser reemplazadas por células sanas. Finalmente, el análisis de los tubos bajo el microscopio no debe tener más de una hora si los tubos no son fijos, ya disminución de la temperatura (temperatura ambiente) pueden afectar la formación del tubo. Todo el ensayo debe completarse dentro de 24 horas para evitar la interrupción de la estructura tubular inducida por la muerte de las células. Es bien sabido que la formación del tubo se caracteriza por múltiples procesos celulares activados incluyendo la migración celular, la adhesión célula-célula, la supervivencia y la apoptosis. Por ejemplo, la migración celular y la adhesión célula-célula son notables durante el desarrollo del tubo. Después de 24 horas, sin embargo, la apoptosis celular se lleva a cabo importantes como la red de discontinuidad es cada vez más frecuente. Este suceso se produce tanto en las células endoteliales y células tumorales derivadas de la formación del tubo.

Es emergentes que este ensayo es fundamental para la evaluación de la actividad tumoral vasculogénica células in vitro, el caso de que sea independiente de la célula endotelial asociada angiogénesis. En este caso, hemos demostrado que las células de melanoma línea B16F1 y el cáncer de mama línea MDA-MB-435 desarrollado redes vasculares en Matrigel, en consonancia con el comportamiento vasculogénica de estos tipos de tumores en humanos como en modelos animales ^14-17. A pesar de la falta de desarrollo de un fenotipo vascular por células HCT116 en Matrigel es mecánica desconocida, se especula que esta propiedad puede ser de tipo vascular de las células tumorales dependientes. Sería interesante saber si las células HCT116 carecen de la capacidad de generar VM en vivo, en comparación con B16F1 y las células MDA-MB-435. Por lo tanto, el establecimiento de este ensayo es de suma importancia en el estudio de la biología del cáncer, la biología vascular, así como la detección de drogas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Growth factor-reduced Matrigel	BD Biosciences	47743-720
EBM2 kit	Lonza Inc.	CC-3156
Nikon ECLIPSE TS100 microscope	Nikon Instruments